辛伐他汀對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞氣體信號(hào)分子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的:膿毒癥(sepsis)是由感染因素所導(dǎo)致的嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征。其發(fā)病率高，病情重，救治難度大，死亡率高達(dá)50％。自青霉素發(fā)現(xiàn)至今人們對(duì)膿毒癥的認(rèn)識(shí)已從關(guān)注感染本身發(fā)展到關(guān)注全身炎癥反應(yīng)這導(dǎo)致病情加重的病理生理過(guò)程之上，發(fā)現(xiàn)控制膿毒癥引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂才是治療的關(guān)鍵。
　　 單核/巨噬細(xì)胞作為重要免疫效應(yīng)細(xì)胞，生成多種炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，對(duì)膿毒癥免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)起著至關(guān)重要的影響。通過(guò)干預(yù)改變細(xì)胞細(xì)胞因子

2、表達(dá)可能是影響炎癥反應(yīng)的重要途徑。辛伐他汀的抗炎作用已得到初步證實(shí)，但其抗炎機(jī)制尚不清楚。辛伐他汀是否通過(guò)單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)影響炎癥反應(yīng)尚未明確證實(shí)，進(jìn)一步了解該藥物對(duì)單核/巨噬細(xì)胞治療過(guò)程中的凋亡狀態(tài)對(duì)于研究膿毒癥的治療有著重要的意義。
　　 炎癥反應(yīng)中氣體一氧化氮（nitricoxide，NO）、一氧化碳(carbonmonoxide，CO)及硫化氫(hydrogensulfide，H2S)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，這三種氣體

3、信號(hào)分子也被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中的3種重要的炎癥介質(zhì)，分別與其主要的合成酶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、血紅素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-gamma-lyase，CSE）形成獨(dú)立又相互聯(lián)系的體系(NO/iNOS體系、CO/HO-1體系、H2S/CSE體系)在許多的研究中被證實(shí)和膿毒癥炎性反應(yīng)有著密切的關(guān)系，對(duì)于

4、維持促炎和抗炎因子的平衡發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，通過(guò)干預(yù)和調(diào)節(jié)這三種氣體信號(hào)分子在炎癥反應(yīng)中的表達(dá)可以明顯減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)損傷，維持膿毒癥的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)穩(wěn)定。
　　 近年來(lái)越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，他汀類藥物可以通過(guò)抑制iNOS的合成從而減少NO的產(chǎn)生，改善膿毒癥或感染性休克的中毒癥狀。而關(guān)于他汀類藥物藥物改善膿毒癥或感染性休克的癥狀是否也通過(guò)除NO外的其他氣體信號(hào)分子發(fā)揮相應(yīng)的作用目前尚不太清楚，他汀類藥物對(duì)膿毒癥單核/巨噬細(xì)胞凋亡

5、的影響也缺乏相關(guān)的研究。
　　 本研究通過(guò)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞體外模擬內(nèi)毒素炎癥模型進(jìn)一步研究辛伐他對(duì)iNOS/NO、HO-1/CO及CSE/H2S的表達(dá)的影響，從而確定辛伐他汀對(duì)氣體信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，觀察辛伐他汀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，探討辛伐他汀抗炎作用機(jī)制，以進(jìn)一步闡明辛伐他汀在膿毒癥及感染性休克治療的作用。
　　 方法:本研究選用小鼠巨噬細(xì)胞系R

6、AW264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)脂多糖LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立體外內(nèi)毒素炎癥模型。實(shí)驗(yàn)分組前首先取正常對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用MTT法選擇合適的辛伐他汀作用濃度，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組:Ⅰ組（對(duì)照組）:完全無(wú)血清培養(yǎng)基孵育;Ⅱ組（模型組）:在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入濃度為1μg/ml的LPS進(jìn)行孵育;Ⅲ組（辛伐他汀組）:完全無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入辛伐他汀20μmol/1，2h后加入1μg/ml的LPS孵育，細(xì)胞培養(yǎng)18小時(shí)后(1)用反轉(zhuǎn)錄-

7、聚合酶鏈反應(yīng)法(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)觀察iNOSmRNA、HO-1mRNA、CSEmRNA在各組的表達(dá)，以目的基因與內(nèi)參的平均光密度比值進(jìn)行半定量分析;用完全單因素方差分析對(duì)于RT-PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinV-fluoresceinisothiocyanate/ProdiumIodidedou

8、blestaining,AnnexinV-FITC/PI)雙染法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、RT-PCR結(jié)果:
　　 1.1、iNOS表達(dá)比較:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、LPS組和辛伐他汀干預(yù)組的iNOS表達(dá)，通過(guò)方差分析三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。進(jìn)行組組間的比較:LPS組iNOS表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組且差異具有顯著性(P＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組iNOS表達(dá)低于LPS組，差異具有顯著性(P

9、＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組iNOS表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)
　　 1.2、HO-1表達(dá)比較:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、LPS組和辛伐他汀干預(yù)組的HO-1表達(dá)，通過(guò)方差分析三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。進(jìn)行組組間的比較:LPS組HO-1表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組且差異具有顯著性(P＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組HO-1表達(dá)高于LPS組，差異具有顯著性（P＜0.05）;辛伐他汀干預(yù)組HO-1表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異

10、具有顯著性(P＜0.05)。
　　 1.3、CSE表達(dá)比較:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、LPS組和辛伐他汀干預(yù)組的CSE表達(dá)，通過(guò)方差分析三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。進(jìn)行組組間的比較:LPS組CSE表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組且差異具有顯著性(P＜0.05）;辛伐他汀干預(yù)組CSE表達(dá)低于LPS組，差異具有顯著性(P＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組CSE表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 2、AnexinV-FI

11、TC&PI雙染法檢測(cè)凋亡:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、LPS組、辛伐他汀干預(yù)組通過(guò)采用單因素方差分析，三組之間的早期凋亡率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。進(jìn)行組組間的比較:LPS組早期凋亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且差異具有顯著性(P＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組早期凋亡率高于LPS組，差異具有顯著性(P＜0.05);辛伐他汀干預(yù)組早期凋亡率高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且差異具有顯著性（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、LPS刺激巨噬細(xì)胞后iNO