神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的:研究外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　方法:取新生1d齡的SD大鼠行成骨細(xì)胞的分離及培養(yǎng),采用“多次貼壁法”純化成骨細(xì)胞及傳代,采用VonKossa’s礦化結(jié)節(jié)染色法進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定。取原代培養(yǎng)第2代末的成骨細(xì)胞,用EDTA(0.01％)-胰蛋白酶(0.125%)消化,將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中,調(diào)整濃度為1×105個(gè)/cm3傳代于細(xì)胞培養(yǎng)瓶

2、中。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用不同濃度的LPS作用24h,對(duì)照組給予等體積空白溶媒。MTT法檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響,確定LPS作用濃度。采用含不同濃度的神經(jīng)元條件培養(yǎng)液(neuron conditioned medium,NCM;分別用培養(yǎng)基稀釋5、10和20倍)或者NGF(100ng/ml,10ng/ml和1ng/ml)的α-MEM培養(yǎng)基,并加入LPS(1μg/ml),陰性對(duì)照給予等體積空白溶媒,分別作用2h、12h和

3、24h后,應(yīng)用一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中NO濃度,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),采用SYBRGREEN法進(jìn)行定量PCR檢測(cè)TNF-α、COX-2和NF-κBmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示,10、5及2.5μg/mlLPS作用24h,細(xì)胞活力與對(duì)照組相比顯著增加,而1.25μg/ml及以下濃度則不影響細(xì)胞活力。采用1μg/mlLPS分別作用細(xì)胞1h、2h、6h、12h及2

4、4h,發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),胞外NO濃度不斷升高,與對(duì)照組相比,在6h具有顯著差異,12h和24h具有極顯著差異。因此選用1μg/mlLPS為造模濃度。1μg/mlLPS作用2h后,各組成骨細(xì)胞NO釋放與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。1μg/mlLPS作用12h和24h可導(dǎo)致成骨細(xì)胞NO釋放顯著升高(p<0.05,p<0.01)。與LPS組相比,1/10濃度NCM在12h時(shí)間點(diǎn)可顯著抑制成骨細(xì)胞NO釋放(p<0.05),1/20、1/10及1/

5、5濃度NCM在24h時(shí)間點(diǎn)均可顯著抑制成骨細(xì)胞NO釋放(p<0.05,p<0.01,p<0.01)。與對(duì)照組相比,1μg/mlLPS及不同濃度NGF作用2h時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞NO釋放無(wú)明顯變化。1μg/mlLPS作用12h和24h后,成骨細(xì)胞NO釋放顯著高于對(duì)照組。與LPS組相比,100ng/mlNGF在12h和24h時(shí)間點(diǎn)可顯著抑制成骨細(xì)胞NO釋放,10ng/mlNGF在24h時(shí)間點(diǎn)可顯著抑制成骨細(xì)胞NO釋放。在此藥物作用濃度范圍內(nèi),細(xì)胞活

6、力不受影響。與對(duì)照組相比,在2h、12h和24h時(shí)間點(diǎn),LPS組TNF-αmRNA表達(dá)顯著升高。與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)LPS組相比,NGF高中劑量組在2h時(shí)可顯著抑制TNF-αmRNA表達(dá)。NGF高中低劑量組在12h時(shí)均可顯著抑制TNF-α、COX-2和NF-κBmRNA表達(dá)。
　　結(jié)論:NGF可通過(guò)抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生NO,減少炎癥介質(zhì)的釋放,同時(shí)可抑制成骨細(xì)胞TNF-α、COX-2和NF-κB的mRNA表達(dá),減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮抗炎作用。