TIGAR在肝癌細胞對表阿霉素耐藥中的作用及相關機制研究.pdf

1、目的：觀察化療藥表阿霉素對肝癌細胞p53誘導的糖酵解和凋亡調節(jié)子（TIGAR）蛋白表達的影響以及TIGAR在肝癌細胞對表阿霉素化療耐受中的作用；探討TIGAR影響肝癌細胞對表阿霉素耐藥的初步機制。
　　方法：Western blot法檢測表阿霉素對肝癌細胞TIGAR蛋白表達的影響；采用小干擾RNA技術干擾肝癌細胞TIGAR表達后通過MTT及克隆形成實驗分別檢測干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細胞生存的短期和長期影響；Ann

2、exin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細胞凋亡的影響；采用慢病毒構建的TIGAR-shRNA感染HepG2肝癌細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，western blot及細胞免疫熒光法檢測干擾效率，得到穩(wěn)轉株后通過裸鼠成瘤實驗檢測干擾TIGAR表達對肝癌腫瘤形成、生長及其對表阿霉素化療療效的影響；2’,7’-二氯二氫熒光素雙醋酸鹽（DCFH2-DA）標記流式細胞術、GSH檢測試劑盒及NADPH檢測試劑

3、盒分別檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平；Western blot檢測細胞內(nèi)凋亡相關蛋白水平；細胞免疫熒光法、western blot及電鏡技術檢測干擾TIGAR表達對肝癌細胞自噬的影響；彗星實驗檢測細胞DNA損傷情況；采用細胞核質分離技術分離細胞核后western blot分別檢測胞漿及胞核中TIGAR的表達；運用細胞免疫熒光及western blot技術檢測DNA損傷修復中相關蛋白ATM、Cdk5等

4、的表達。
　　結果：為了研究表阿霉素對肝癌細胞TIGAR表達的影響，我們采用不同濃度的表阿霉素作用肝癌HepG2細胞不同時間后，western blot檢測TIGAR表達，結果顯示，低濃度短時間的表阿霉素作用可誘導HepG2肝癌細胞TIGAR表達，高濃度長時間的表阿霉素作用后TIGAR表達下調。且表阿霉素誘導的TIGAR表達是依賴p53變化的。為了進一步探討表阿霉素誘導的肝癌細胞TIGAR高表達在肝癌細胞對表阿霉素療效中的作用，我

5、們采用小干擾RNA干擾肝癌HepG2細胞TIGAR表達后通過MTT、克隆形成實驗及流式等體外實驗檢測發(fā)現(xiàn)，干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用后肝癌HepG2細胞的存活明顯下降，細胞凋亡顯著增加；此外，通過體內(nèi)實驗即裸鼠成瘤實驗檢測干擾TIGAR表達對肝癌細胞成瘤的影響以及移植瘤對表阿霉素療效的影響，結果顯示，干擾TIGAR表達抑制肝癌的形成和生長，同時也增加了其對表阿霉素的化療敏感性。研究還發(fā)現(xiàn)，不僅對于肝癌細胞，表阿霉素也增加了肺癌A

6、549細胞的TIGAR表達且干擾TIGAR表達增加肺癌A549細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　腫瘤的化療耐受與多種機制相關，其中ROS適應性反應、細胞自噬及細胞DNA損傷修復在腫瘤化療耐藥的形成中起著重要作用，TIGAR作為p53下游基因，通過抑制細胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH降低細胞內(nèi)ROS水平，從而降低ROS引起的細胞凋亡、ROS介導的細胞自噬激活及ROS誘導的DNA損傷修復，此外，磷酸戊糖通路的激活增加了DNA

7、合成原料核苷酸的生成，有利于受損DNA的修復。因此，為了進一步探討干擾TIGAR表達在肝癌細胞對表阿霉素化療增敏中的機制，我們從細胞凋亡、細胞自噬及細胞DNA損傷修復三方面來進行研究。
　　第一，干擾TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導的肝癌細胞凋亡，并與ROS水平增加、Caspase3激活相關。采用 NADPH或 NAC清除細胞 ROS水平或采用Z-VAD-FMK抑制Caspase3后可部分減輕細胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達增

8、加肝癌細胞對表阿霉素化療敏感性與干擾TIGAR表達增加細胞凋亡有關。
　　第二，干擾TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導的肝癌細胞自噬激活，表現(xiàn)為LC3 I向LC3 II轉化增加、自噬體增多及自噬底物p62蛋白水平的下調。干擾TIGAR表達增加表阿霉素誘導的肝癌細胞自噬激活通過增加細胞ROS水平及抑制mTOR通路來實現(xiàn)，NADPH清除ROS后可部分抑制干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用激活的自噬。采用3-MA或干擾Atg5抑制細胞自

9、噬后進一步增加了干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用所致的肝癌細胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達增加表阿霉素誘導的肝癌細胞自噬激活對細胞的生存起保護作用，能夠抵抗表阿霉素的毒性作用，在此基礎上抑制細胞自噬能得到額外的抗腫瘤效果。即干擾TIGAR誘導的細胞自噬激活降低肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　第三，TIGAR增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH減少細胞ROS從而減少DNA損傷，此外，產(chǎn)生的戊糖作為DNA合成原料有利于受損DNA的

10、修復。表阿霉素除了誘導肝癌細胞TIGAR表達外還促進其入核，調控腫瘤細胞DNA損傷修復。干擾 TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導的肝癌細胞DNA損傷，當給予磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的戊糖、NADPH或ROS清除劑NAC后可部分緩解DNA損傷。提示干擾TIGAR表達除了通過抑制磷酸戊糖通路增加表阿霉素誘導的肝癌細胞DNA損傷外，還有其他機制的存在。進一步實驗研究顯示，TIGAR通過調節(jié)Cdk5來磷酸化DNA損傷修復關鍵蛋白ATM進而調控細胞DNA

11、損傷修復。綜上，TIGAR通過磷酸戊糖途徑及Cdk5-AMT信號通路來調控表阿霉素對肝癌細胞DNA的損傷與修復進而影響肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　結論：表阿霉素誘導肝癌細胞TIGAR表達；干擾TIGAR表達增加肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性，其機制涉及細胞凋亡增加、自噬水平激活以及細胞DNA的損傷與修復。TIGAR表達在肝癌細胞對表阿霉素耐受中的作用提示TIGAR成為抗腫瘤治療作用靶點的可能，為臨床抗腫瘤治療尤其是對表阿