TIGAR在肝癌細(xì)胞對表阿霉素耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察化療藥表阿霉素對肝癌細(xì)胞p53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)子（TIGAR）蛋白表達(dá)的影響以及TIGAR在肝癌細(xì)胞對表阿霉素化療耐受中的作用；探討TIGAR影響肝癌細(xì)胞對表阿霉素耐藥的初步機(jī)制。
　　方法：Western blot法檢測表阿霉素對肝癌細(xì)胞TIGAR蛋白表達(dá)的影響；采用小干擾RNA技術(shù)干擾肝癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)后通過MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測干擾TIGAR表達(dá)聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細(xì)胞生存的短期和長期影響；Ann

2、exin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測干擾TIGAR表達(dá)聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細(xì)胞凋亡的影響；采用慢病毒構(gòu)建的TIGAR-shRNA感染HepG2肝癌細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，western blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測干擾效率，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株后通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測干擾TIGAR表達(dá)對肝癌腫瘤形成、生長及其對表阿霉素化療療效的影響；2’,7’-二氯二氫熒光素雙醋酸鹽（DCFH2-DA）標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、GSH檢測試劑盒及NADPH檢測試劑

3、盒分別檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平；細(xì)胞免疫熒光法、western blot及電鏡技術(shù)檢測干擾TIGAR表達(dá)對肝癌細(xì)胞自噬的影響；彗星實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞DNA損傷情況；采用細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)分離細(xì)胞核后western blot分別檢測胞漿及胞核中TIGAR的表達(dá)；運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光及western blot技術(shù)檢測DNA損傷修復(fù)中相關(guān)蛋白ATM、Cdk5等

4、的表達(dá)。
　　結(jié)果：為了研究表阿霉素對肝癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)的影響，我們采用不同濃度的表阿霉素作用肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，western blot檢測TIGAR表達(dá)，結(jié)果顯示，低濃度短時(shí)間的表阿霉素作用可誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)，高濃度長時(shí)間的表阿霉素作用后TIGAR表達(dá)下調(diào)。且表阿霉素誘導(dǎo)的TIGAR表達(dá)是依賴p53變化的。為了進(jìn)一步探討表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞TIGAR高表達(dá)在肝癌細(xì)胞對表阿霉素療效中的作用，我

5、們采用小干擾RNA干擾肝癌HepG2細(xì)胞TIGAR表達(dá)后通過MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式等體外實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，干擾TIGAR表達(dá)聯(lián)合表阿霉素作用后肝癌HepG2細(xì)胞的存活明顯下降，細(xì)胞凋亡顯著增加；此外，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)即裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測干擾TIGAR表達(dá)對肝癌細(xì)胞成瘤的影響以及移植瘤對表阿霉素療效的影響，結(jié)果顯示，干擾TIGAR表達(dá)抑制肝癌的形成和生長，同時(shí)也增加了其對表阿霉素的化療敏感性。研究還發(fā)現(xiàn)，不僅對于肝癌細(xì)胞，表阿霉素也增加了肺癌A

6、549細(xì)胞的TIGAR表達(dá)且干擾TIGAR表達(dá)增加肺癌A549細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　腫瘤的化療耐受與多種機(jī)制相關(guān)，其中ROS適應(yīng)性反應(yīng)、細(xì)胞自噬及細(xì)胞DNA損傷修復(fù)在腫瘤化療耐藥的形成中起著重要作用，TIGAR作為p53下游基因，通過抑制細(xì)胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而降低ROS引起的細(xì)胞凋亡、ROS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬激活及ROS誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，此外，磷酸戊糖通路的激活增加了DNA

7、合成原料核苷酸的生成，有利于受損DNA的修復(fù)。因此，為了進(jìn)一步探討干擾TIGAR表達(dá)在肝癌細(xì)胞對表阿霉素化療增敏中的機(jī)制，我們從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬及細(xì)胞DNA損傷修復(fù)三方面來進(jìn)行研究。
　　第一，干擾TIGAR表達(dá)顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，并與ROS水平增加、Caspase3激活相關(guān)。采用 NADPH或 NAC清除細(xì)胞 ROS水平或采用Z-VAD-FMK抑制Caspase3后可部分減輕細(xì)胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達(dá)增

8、加肝癌細(xì)胞對表阿霉素化療敏感性與干擾TIGAR表達(dá)增加細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第二，干擾TIGAR表達(dá)顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬激活，表現(xiàn)為LC3 I向LC3 II轉(zhuǎn)化增加、自噬體增多及自噬底物p62蛋白水平的下調(diào)。干擾TIGAR表達(dá)增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬激活通過增加細(xì)胞ROS水平及抑制mTOR通路來實(shí)現(xiàn)，NADPH清除ROS后可部分抑制干擾TIGAR表達(dá)聯(lián)合表阿霉素作用激活的自噬。采用3-MA或干擾Atg5抑制細(xì)胞自

9、噬后進(jìn)一步增加了干擾TIGAR表達(dá)聯(lián)合表阿霉素作用所致的肝癌細(xì)胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達(dá)增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬激活對細(xì)胞的生存起保護(hù)作用，能夠抵抗表阿霉素的毒性作用，在此基礎(chǔ)上抑制細(xì)胞自噬能得到額外的抗腫瘤效果。即干擾TIGAR誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬激活降低肝癌細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　第三，TIGAR增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH減少細(xì)胞ROS從而減少DNA損傷，此外，產(chǎn)生的戊糖作為DNA合成原料有利于受損DNA的

10、修復(fù)。表阿霉素除了誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)外還促進(jìn)其入核，調(diào)控腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。干擾 TIGAR表達(dá)顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞DNA損傷，當(dāng)給予磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的戊糖、NADPH或ROS清除劑NAC后可部分緩解DNA損傷。提示干擾TIGAR表達(dá)除了通過抑制磷酸戊糖通路增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞DNA損傷外，還有其他機(jī)制的存在。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究顯示，TIGAR通過調(diào)節(jié)Cdk5來磷酸化DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白ATM進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞DNA

11、損傷修復(fù)。綜上，TIGAR通過磷酸戊糖途徑及Cdk5-AMT信號通路來調(diào)控表阿霉素對肝癌細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　結(jié)論：表阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)；干擾TIGAR表達(dá)增加肝癌細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性，其機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡增加、自噬水平激活以及細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù)。TIGAR表達(dá)在肝癌細(xì)胞對表阿霉素耐受中的作用提示TIGAR成為抗腫瘤治療作用靶點(diǎn)的可能，為臨床抗腫瘤治療尤其是對表阿