TIGAR在肝癌細胞對表阿霉素耐藥中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的：觀察化療藥表阿霉素對肝癌細胞p53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)子（TIGAR）蛋白表達的影響以及TIGAR在肝癌細胞對表阿霉素化療耐受中的作用；探討TIGAR影響肝癌細胞對表阿霉素耐藥的初步機制。
　　方法：Western blot法檢測表阿霉素對肝癌細胞TIGAR蛋白表達的影響；采用小干擾RNA技術(shù)干擾肝癌細胞TIGAR表達后通過MTT及克隆形成實驗分別檢測干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細胞生存的短期和長期影響；Ann

2、exin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素治療對肝癌細胞凋亡的影響；采用慢病毒構(gòu)建的TIGAR-shRNA感染HepG2肝癌細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，western blot及細胞免疫熒光法檢測干擾效率，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株后通過裸鼠成瘤實驗檢測干擾TIGAR表達對肝癌腫瘤形成、生長及其對表阿霉素化療療效的影響；2’,7’-二氯二氫熒光素雙醋酸鹽（DCFH2-DA）標(biāo)記流式細胞術(shù)、GSH檢測試劑盒及NADPH檢測試劑

3、盒分別檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平；Western blot檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平；細胞免疫熒光法、western blot及電鏡技術(shù)檢測干擾TIGAR表達對肝癌細胞自噬的影響；彗星實驗檢測細胞DNA損傷情況；采用細胞核質(zhì)分離技術(shù)分離細胞核后western blot分別檢測胞漿及胞核中TIGAR的表達；運用細胞免疫熒光及western blot技術(shù)檢測DNA損傷修復(fù)中相關(guān)蛋白ATM、Cdk5等

4、的表達。
　　結(jié)果：為了研究表阿霉素對肝癌細胞TIGAR表達的影響，我們采用不同濃度的表阿霉素作用肝癌HepG2細胞不同時間后，western blot檢測TIGAR表達，結(jié)果顯示，低濃度短時間的表阿霉素作用可誘導(dǎo)HepG2肝癌細胞TIGAR表達，高濃度長時間的表阿霉素作用后TIGAR表達下調(diào)。且表阿霉素誘導(dǎo)的TIGAR表達是依賴p53變化的。為了進一步探討表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞TIGAR高表達在肝癌細胞對表阿霉素療效中的作用，我

5、們采用小干擾RNA干擾肝癌HepG2細胞TIGAR表達后通過MTT、克隆形成實驗及流式等體外實驗檢測發(fā)現(xiàn)，干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用后肝癌HepG2細胞的存活明顯下降，細胞凋亡顯著增加；此外，通過體內(nèi)實驗即裸鼠成瘤實驗檢測干擾TIGAR表達對肝癌細胞成瘤的影響以及移植瘤對表阿霉素療效的影響，結(jié)果顯示，干擾TIGAR表達抑制肝癌的形成和生長，同時也增加了其對表阿霉素的化療敏感性。研究還發(fā)現(xiàn)，不僅對于肝癌細胞，表阿霉素也增加了肺癌A

6、549細胞的TIGAR表達且干擾TIGAR表達增加肺癌A549細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　腫瘤的化療耐受與多種機制相關(guān)，其中ROS適應(yīng)性反應(yīng)、細胞自噬及細胞DNA損傷修復(fù)在腫瘤化療耐藥的形成中起著重要作用，TIGAR作為p53下游基因，通過抑制細胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH降低細胞內(nèi)ROS水平，從而降低ROS引起的細胞凋亡、ROS介導(dǎo)的細胞自噬激活及ROS誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，此外，磷酸戊糖通路的激活增加了DNA

7、合成原料核苷酸的生成，有利于受損DNA的修復(fù)。因此，為了進一步探討干擾TIGAR表達在肝癌細胞對表阿霉素化療增敏中的機制，我們從細胞凋亡、細胞自噬及細胞DNA損傷修復(fù)三方面來進行研究。
　　第一，干擾TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡，并與ROS水平增加、Caspase3激活相關(guān)。采用 NADPH或 NAC清除細胞 ROS水平或采用Z-VAD-FMK抑制Caspase3后可部分減輕細胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達增

8、加肝癌細胞對表阿霉素化療敏感性與干擾TIGAR表達增加細胞凋亡有關(guān)。
　　第二，干擾TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬激活，表現(xiàn)為LC3 I向LC3 II轉(zhuǎn)化增加、自噬體增多及自噬底物p62蛋白水平的下調(diào)。干擾TIGAR表達增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬激活通過增加細胞ROS水平及抑制mTOR通路來實現(xiàn)，NADPH清除ROS后可部分抑制干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用激活的自噬。采用3-MA或干擾Atg5抑制細胞自

9、噬后進一步增加了干擾TIGAR表達聯(lián)合表阿霉素作用所致的肝癌細胞凋亡。提示，干擾TIGAR表達增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬激活對細胞的生存起保護作用，能夠抵抗表阿霉素的毒性作用，在此基礎(chǔ)上抑制細胞自噬能得到額外的抗腫瘤效果。即干擾TIGAR誘導(dǎo)的細胞自噬激活降低肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　第三，TIGAR增加磷酸戊糖通路產(chǎn)生NADPH減少細胞ROS從而減少DNA損傷，此外，產(chǎn)生的戊糖作為DNA合成原料有利于受損DNA的

10、修復(fù)。表阿霉素除了誘導(dǎo)肝癌細胞TIGAR表達外還促進其入核，調(diào)控腫瘤細胞DNA損傷修復(fù)。干擾 TIGAR表達顯著增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞DNA損傷，當(dāng)給予磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的戊糖、NADPH或ROS清除劑NAC后可部分緩解DNA損傷。提示干擾TIGAR表達除了通過抑制磷酸戊糖通路增加表阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞DNA損傷外，還有其他機制的存在。進一步實驗研究顯示，TIGAR通過調(diào)節(jié)Cdk5來磷酸化DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白ATM進而調(diào)控細胞DNA

11、損傷修復(fù)。綜上，TIGAR通過磷酸戊糖途徑及Cdk5-AMT信號通路來調(diào)控表阿霉素對肝癌細胞DNA的損傷與修復(fù)進而影響肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性。
　　結(jié)論：表阿霉素誘導(dǎo)肝癌細胞TIGAR表達；干擾TIGAR表達增加肝癌細胞對表阿霉素的化療敏感性，其機制涉及細胞凋亡增加、自噬水平激活以及細胞DNA的損傷與修復(fù)。TIGAR表達在肝癌細胞對表阿霉素耐受中的作用提示TIGAR成為抗腫瘤治療作用靶點的可能，為臨床抗腫瘤治療尤其是對表阿