阿霉素對肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的
　　檢測不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系在阿霉素及Calpain-2抑制劑作用后,干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況,探討肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制,為臨床干預(yù)治療設(shè)計新的分子靶點提供依據(jù)。
　　方法
　　第一部分：阿霉素(ADM)干預(yù)后不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系中干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)
　　選用轉(zhuǎn)移能力不同的人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L、HCCLM3為模型細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng);MTT法檢測阿霉素對肝癌細(xì)胞系的半數(shù)致死量LD50(72h);通

2、過蛋白免疫印跡法(Westernblot)分析兩株模型細(xì)胞干細(xì)胞基因Nanog、Oct-4、Sox2、Wnt5b的表達(dá)水平;予半數(shù)致死量處理模型細(xì)胞,通過Westernblot分析不同時間段模型細(xì)胞干細(xì)胞基因Nanog、Oct-4、Sox2、Wnt5b表達(dá)的變化。
　　第二部分：Calpain2抑制劑CalpainInhibitorVI對ADM干預(yù)下不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系干細(xì)胞基因表達(dá)的影響
　　常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系MHCC

3、97-L、HCCLM3,細(xì)胞生長達(dá)對數(shù)生長期時,將模型細(xì)胞分為以下兩組組分別處理:(1)陰性對照組:只給予半數(shù)致死量ADM處理細(xì)胞;(2)CalpainInhibitorVI作用組:同時給予半數(shù)致死量ADM及CalpainInhibitorVI處理細(xì)胞,通過蛋白免疫印跡法檢測兩組組細(xì)胞系中干細(xì)胞基因Nanog、Oct-4、Sox2、Wnt5b的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1、ADM對肝癌細(xì)胞MHCC97-L半數(shù)致死量為0.42

4、33μmol/L,對HCCLM3半數(shù)致死量為0.5459μmol/L;
　　2、干細(xì)胞相關(guān)基因Wnt5b、Nanog在不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系MHCC97-L和HCCLM3中均有不同程度表達(dá),Sox2僅在高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系HCCLM3中表達(dá),Oct-4基因蛋白在兩株細(xì)胞系中均不表達(dá);
　　3、ADM(LD50)作用下,不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系中,干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)存在差異。
　　4、肝癌細(xì)胞系MHCC97-L和HCCL

5、M3在ADM半數(shù)致死量短時間(4h以內(nèi))作用下,隨ADM作用時間的延長,Wnt5b蛋白表達(dá)水平逐漸增高(P<0.05),Nanog蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05);長時間(超過12h)作用下,隨ADM作用時間的延長,Wnt5b蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05),Nanog蛋白表達(dá)水平逐漸增高(P<0.05)。
　　5、高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系HCCLM3在ADM(LD50)作用下,隨ADM作用時間的延長,Sox2蛋白表達(dá)水平逐漸

6、增高(P<0.05)
　　第二部分:
　　ADM影響下予Calpain2抑制劑CalpainInhibitorVI干預(yù)肝癌細(xì)胞系,人肝癌細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog、Sox2表達(dá)降低;Wnt5b表達(dá)增強(qiáng)。
　　結(jié)論
　　1.ADM促進(jìn)MHCC97-L及HCCLM3細(xì)胞的凋亡,且對MHCC97-L的作用強(qiáng)于HCCLM3。
　　2.干細(xì)胞相關(guān)基因Wnt5b與肝癌細(xì)胞的惡性程度呈負(fù)性相關(guān)。
　　3.干細(xì)胞相