阿霉素誘導(dǎo)耐藥肝癌細(xì)胞株miRNAs表達(dá)譜檢測(cè)及miR-1246作用研究.pdf

1、第一章人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM的建立及其與人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721及人正常肝細(xì)胞株LO2的miRNAs表達(dá)譜分析
　　目的
　　探討人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM與其親本細(xì)胞SMMC-7721及人正常肝細(xì)胞株LO2的miRNAs的差異表達(dá)
　　方法
　　(1) MTT法測(cè)定阿霉素對(duì)SMMC-7721的IC50，以其為起始濃度及采用順濃度梯度法培養(yǎng)SMMC-7721，建立耐藥細(xì)胞

2、株SMMC-7721/ADM，繪制兩細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線及計(jì)算倍增時(shí)間，MTT法測(cè)ADM對(duì)SMMC-7721/ADM的IC50及計(jì)算耐藥指數(shù)，westernblotting測(cè)定LO2，SMMC-7721及SMMC-7721/ADM的MDR1蛋白表達(dá)。
　　(2) miRNA芯片分析人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721與SMMC-7721/ADM及人正常肝細(xì)胞株LO2中差異表達(dá)的miRNAs，并采用RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　結(jié)果<

3、br>　　(1) ADM對(duì)SMMC-7721的IC50為0.12±0.01μg/ml，兩細(xì)胞株有相似的生長(zhǎng)曲線，倍增時(shí)間無明顯差異(p＞0.05)，ADM對(duì)SMMC-7721/ADM的IC50為2.96±0.12μg/ml。耐藥指數(shù)為24.67。MDR1蛋白在SMMC-7721/ADM中表達(dá)高于其親本細(xì)胞SMMC-7721及LO2(p＜0.05)，SMMC-7721高于正常肝細(xì)胞株LO2(p＜0.05)。
　　(2)通過芯片篩選，

4、 LO2與SMMC-7721相比，上調(diào)2倍以上的miRNAs有189個(gè)，下調(diào)2倍以上的有246個(gè)。SMMC-7721與SMMC-7721/ADM上調(diào)2倍以上的有176個(gè)，下調(diào)2倍以上的有159個(gè)。SMMC-7721/ADM與LO2相比上調(diào)2倍的有160個(gè)，下調(diào)2倍的有134個(gè)。在LO2，SMMC-7721，SMMC-7721/ADM中表達(dá)差異兩倍以上且依次上調(diào)的有miR-1246，miR-3676-5p，miR-4443，依次下調(diào)的有m

5、iR-101-3p， miR-1469。RT-PCR驗(yàn)證了miR-1246與miR-1469在LO2，SMMC-7721，SMMC-7721/ADM中的表達(dá)量，其結(jié)果與芯片相一致(p＞0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)我們成功構(gòu)建了SMMC-7721/ADM。
　　(2)通過對(duì)LO2，SMMC-7721，及SMMC-7721/ADM的miRNA芯片分析篩選出依次顯著上調(diào)的miR-1246， miR-3676-5p和mi

6、R-4443;和依次顯著下調(diào)的有miR-101-3p，miR-1469。并對(duì)miR-1246與miR-1469進(jìn)行驗(yàn)證，證明了芯片結(jié)果的可靠性。
　　第二章miR-1246在肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM的研究
　　目的：
　　探討miR-1246在人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM中的作用研究
　　方法：
　　(1)設(shè)計(jì)及合成miR-1246 inhibitor片段，轉(zhuǎn)染至SMMC-77

7、21/ADM，RT-PCR測(cè)定SMMC-7721，SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組及SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組及中miR-1246的表達(dá)量。
　　(2)實(shí)驗(yàn)分組:A組為SMMC-7721，B組為SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組，C組為SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組。
　　(3) MTT檢測(cè)三組細(xì)胞株的增殖能力，并測(cè)定ADM對(duì)SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組的IC50。
　　(4)FCM檢測(cè)三

8、組細(xì)胞株的細(xì)胞周期。
　　(5) FCM AV-PI檢測(cè)三組細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡。
　　(6) Transwell檢測(cè)三組細(xì)胞株的遷移能力。
　　(7)鋪matrigel的Transwell檢測(cè)三組細(xì)胞株的侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　(1)顯微熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)到85％左右，目的轉(zhuǎn)染組miR-1246含量低于空白轉(zhuǎn)染組(p＜0.05)，與SMMC-7721無明顯差異(p＞0.05)。
　　(2)MTT

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組的增殖能力較A、B組下降(p＜0.05)，B組與A組無明顯差異(p＞0.05)。ADM對(duì)C組的IC50為0.08±0.01μg/ml。與SMMC-7721/ADM的IC50(2.96±0.12μg/ml)相比顯著下降(p＜0.01)，與SMMC-7721（0.12±0.01μg/ml）相比無明顯差異(p＞0.05)。
　　(3)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)示三組細(xì)胞株各周期之比無明顯差異(P＞0.05)
　　(4)細(xì)胞凋亡實(shí)

10、驗(yàn)示C組與A、B組相比其凋亡率升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，B組與A組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(5)遷移能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組的遷移能力低于B組(p＜0.05)，與A組則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，B組遷移能力高于A組(p＜0.05)。
　　(6)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組的侵襲能力低于B組，與A組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，B組侵襲能力高于A組(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)

11、在SMMC-7721/ADM中，通過與親本細(xì)胞SMMC-7721分析，細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡無明顯差異，而遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)。提示miR-1246的上調(diào)可能參與SMMC-7721/ADM的侵襲遷移能力的提高。
　　(2)通過對(duì)轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor的SMMC-7721/ADM分析，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡數(shù)增加。提示miR-1246的上調(diào)可增加耐藥肝癌細(xì)胞株的增殖能力，抑制凋亡，但對(duì)細(xì)胞周期無明顯影響;細(xì)胞

12、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)的降低表明miR-1246的上調(diào)可提高耐藥肝癌細(xì)胞株的遷移與侵襲能力，轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor的SMMC-7721/ADM的48h IC50明顯下降，提示miR-1246的下調(diào)使ADM對(duì)SMMC-7721/ADM敏感性增加
　　第三章hsa-miR-1246的生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)驗(yàn)證
　　目的：
　　對(duì)has-miR-1246進(jìn)行生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)和在耐藥肝癌細(xì)胞株中的靶基因

13、驗(yàn)證。
　　方法：
　　(1)通過TargetScan、miRanDa和miRDB三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，對(duì)其進(jìn)行靶基因初步篩選，選擇3個(gè)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)的交集基因行下一步預(yù)測(cè)研究。用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-1246的靶基因集合行GO注釋和KEGG的生物通路富集分析。
　　(2)確立在肝癌耐藥細(xì)胞株中的靶基因，并采用western-blotting及RT-PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　(1) hsa-miR-124

14、6在TargetScan、miRanDa、 miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因，其結(jié)果為TargetScan為178個(gè)，miRanDa為5983個(gè)，miRDB為398個(gè)，總共交集預(yù)測(cè)靶基因?yàn)?7個(gè)。其中GSK3β，UNC5，SEMA6a參與KEGG通路為AXON GUIDANCE通路（Rho GTPase1家族通路）。
　　(2) GSK3β蛋白和mRNA表達(dá)在SMMC-7721/ADM目的轉(zhuǎn)染組均高于SMMC-7721/ADM空白轉(zhuǎn)染組