人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分:抑制Notch信號(hào)通過PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路作用于自噬發(fā)生對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響
　　人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的主要細(xì)胞成分之一，在調(diào)控微環(huán)境中干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和維持干細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要作用。BM-MSCs分化能力的

2、異常，通過改變其正常BM-MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力和造血支持功能，從而在各種血液性疾病和相應(yīng)免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)通路(Notchsignaling pathway)是一條經(jīng)典的跨膜信號(hào)通路，通過受體與配體結(jié)合，作用于PI3K/Akt通路在調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育和凋亡中發(fā)揮重要作用，而PI3K/Akt/mTOR通路作為自噬(autophagy)的調(diào)控信號(hào)，是自噬發(fā)生中重要的靶點(diǎn)。此外，研究認(rèn)為自噬的發(fā)生在細(xì)胞生長和分化中起著

3、重要作用。因此，以PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討Notch信號(hào)與自噬發(fā)生在BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中的作用，為闡述臨床疾病中MSCs的異常分化提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:研究Notch信號(hào)通路和自噬發(fā)生在正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)變化情況，并進(jìn)一步闡明Notch信號(hào)和自噬發(fā)生在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化中發(fā)揮作用可能涉及的機(jī)制，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。
　

4、　方法:(1)采用貼壁、傳代培養(yǎng)方法獲得正常人骨髓組織中BM-MSCs;通過成脂誘導(dǎo)分化和成骨誘導(dǎo)分化檢測BM-MSCs多向分化潛能;流式細(xì)胞儀檢測BM-MSCs免疫表型。(2)應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中Notch信號(hào)和自噬水平的表達(dá)變化情況。(3)篩選不同濃度Notch信號(hào)抑制劑DAPT（0μM、2.5μM、5μM和10μM）對(duì)BM-MSCs中Notch信號(hào)表達(dá)抑制情況

5、。(4)在BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中，加用Notch信號(hào)抑制劑DAPT(5μM)，通過油紅O染色和Real-time PCR檢測成脂相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα mRNA表達(dá)變化，評(píng)價(jià)抑制Notch信號(hào)對(duì)BM-MSCs成脂分化能力的影響。(5)應(yīng)用自噬抑制劑3-MA(5 mM)或氯喹(20μM)抑制BM-MSCs分化早期自噬發(fā)生，同時(shí)單用或聯(lián)合應(yīng)用DAPT，驗(yàn)證自噬發(fā)生對(duì)DAPT促BM-MSCs成脂分化能力產(chǎn)生影響。(6)采用

6、Western blot檢測BM-MSCs成脂分化過程中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中相應(yīng)蛋白表達(dá)變化情況。(7)應(yīng)用MDC染色、透射電鏡和Western blot聯(lián)合檢測，探討Notch信號(hào)抑制劑DAPT是否通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)對(duì)BM-MSCs自噬發(fā)生產(chǎn)生影響。(8) Western blot方法和共聚焦染色方法檢測自噬抑制劑3-MA（5mM）或氯喹(20μM)對(duì)DAPT促BM-MSCs自噬發(fā)生的逆轉(zhuǎn)作用。

7、　　結(jié)果:(1)成功分離培養(yǎng)獲得高純度的人BM-MSCs，正常BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或多角形，旋渦狀生長;具有成脂誘導(dǎo)分化和成骨誘導(dǎo)分化能力;流式細(xì)胞儀檢測BM-MSCs免疫表型，其高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD05和CD166，不表達(dá)CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。(2) BM-MSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)分化14天，Notch受體NOTCH1、NOTCH2和NOTCH3 mRNA明顯降低(

8、P＜0.05)，NOTCH4mRNA有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Notch配體DLL1、DLL3、DLL4、DLK1和DLK2 mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，Jagged1和Jagged2 mRNA無明顯變化(P＞0.05);Notch信號(hào)依賴的轉(zhuǎn)錄因子HEY1下降明顯(P＜0.05)，HES1和HEY2無明顯變化(P＞0.05)。(3)在BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化早期，自噬相關(guān)蛋白LC-3和Beclin1表達(dá)量

9、顯著升高，表明在分化早期自噬水平增加，隨著BM-MSCs成脂誘導(dǎo)時(shí)間延長，自噬水平逐漸降低。(4)5μMDAPT能夠有效抑制BM-MSCs中Notch信號(hào)的表達(dá)。(5) BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中，單獨(dú)加入Notch信號(hào)抑制劑DAPT(5μM)，或聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA(5mM)或氯喹(20μM)，通過油紅O染色和成脂相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα mRNA檢測證實(shí)，DAPT可能通過激活自噬發(fā)生而促進(jìn)BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分

10、化。(6)PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路在BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中伴隨成脂誘導(dǎo)進(jìn)程發(fā)生時(shí)間相關(guān)性改變。(7) Notch抑制劑DAPT通過作用于PTEN-PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)BM-MSCs自噬的發(fā)生。
　　結(jié)論:BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化過程中Notch信號(hào)表達(dá)降低，而細(xì)胞自噬水平在BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化早期激活;Notch信號(hào)抑制劑DAPT能夠促進(jìn)BM-MSCs成脂誘導(dǎo)分化，而抑制分化早期

11、自噬的發(fā)生能夠逆轉(zhuǎn)DAPT的促成脂作用;DAPT抑制Notch信號(hào)通過作用于PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路激活BM-MSCs自噬發(fā)生從而促進(jìn)其成脂分化。
　　第二部分:半乳糖凝集素在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化和成骨分化達(dá)變化
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchmal stem cells，MSCs)因其具有自我更新和多向分化潛能而被廣泛應(yīng)用于組織損傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中。MSCs來源十分廣泛，可從骨髓、脂肪、臍帶

12、和胎盤等眾多組織中分離獲得，其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)因其具有取材容易，體外擴(kuò)增快且不涉及倫理問題等特點(diǎn)受到更多關(guān)注。成脂分化和成骨分化作為MSCs主要的分化方向，對(duì)于探索MSCs功能試驗(yàn)和臨床研究具有重要意義。半乳糖凝集素（Galectins）作為β-半乳糖苷結(jié)合凝集素家族中的一員在調(diào)控細(xì)胞免疫、抗原識(shí)別、神經(jīng)發(fā)生和血管生成中具有重

13、要作用，最新研究認(rèn)為家族中某些亞型參與了細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞生成，但是目前對(duì)于Galectins在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化中的作用尚不明確。
　　目的:檢測Galectins家族成員在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中的表達(dá)變化情況，為進(jìn)一步研究hUC-MSCs分化功能提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)分離提純?nèi)四殠чg充質(zhì)干細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測其間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型，油紅O染色、Von Kossa染色和

14、茜素紅染色觀察其成脂分化和成骨分化能力，鑒定分離的hUC-MSCs;(2) RT-PCR半定量檢測hUC-MSCs內(nèi)Galectins各成員(Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-12、Gal-13和Gal-14)表達(dá)變化情況，篩選出其高表達(dá)亞型;(3)Real-time PCR檢測hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中不同時(shí)間段（第0天、1天、3天、7天、14天和2

15、1天）Gal-1、Gal-3、Gal-8和Gal-9 mRNA表達(dá)變化情況;(4)收集hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中不同時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過ELISA檢測Gal-1和Gal-9分泌蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)所分離hUC-MSCs高表達(dá)D29、CD73、CD90、CD105、CD44、CD166和HLA-ABC，不表達(dá)CD14、CD31、CD45、CD133和HLA-DR，且在體外誘導(dǎo)條件下，具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞

16、成分化能力。(2) hUC-MSCs細(xì)胞表達(dá)Galectins家族中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-12和Gal-13亞型，其中Gal-1、Gal-3、Gal-8和Gal-9 mRNA表達(dá)量較高。(3)Gal-1 mRNA和Gal-9 mRNA在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中隨誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)程逐漸降低;而Gal-3mRNA和Gal-8 mRNA在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過