人間充質干細胞成脂分化調控機制的研究.pdf

1、本文分為兩個部分進行探討：
　　第一部分:抑制Notch信號通過PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路作用于自噬發(fā)生對人骨髓間充質干細胞成脂分化的影響
　　人骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，是構成骨髓微環(huán)境的主要細胞成分之一，在調控微環(huán)境中干細胞穩(wěn)態(tài)和維持干細胞的功能中發(fā)揮重要作用。BM-MSCs分化能力的

2、異常，通過改變其正常BM-MSCs的免疫調節(jié)能力和造血支持功能，從而在各種血液性疾病和相應免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。Notch信號通路(Notchsignaling pathway)是一條經典的跨膜信號通路，通過受體與配體結合，作用于PI3K/Akt通路在調控細胞生長、發(fā)育和凋亡中發(fā)揮重要作用，而PI3K/Akt/mTOR通路作為自噬(autophagy)的調控信號，是自噬發(fā)生中重要的靶點。此外，研究認為自噬的發(fā)生在細胞生長和分化中起著

3、重要作用。因此，以PI3K/Akt/mTOR信號通路為切入點，探討Notch信號與自噬發(fā)生在BM-MSCs成脂誘導分化過程中的作用，為闡述臨床疾病中MSCs的異常分化提供理論基礎。
　　目的:研究Notch信號通路和自噬發(fā)生在正常骨髓間充質干細胞成脂誘導分化過程中的表達變化情況，并進一步闡明Notch信號和自噬發(fā)生在骨髓間充質干細胞成脂誘導分化中發(fā)揮作用可能涉及的機制，為研究間充質干細胞的成脂分化提供實驗支持和理論依據。
　

4、　方法:(1)采用貼壁、傳代培養(yǎng)方法獲得正常人骨髓組織中BM-MSCs;通過成脂誘導分化和成骨誘導分化檢測BM-MSCs多向分化潛能;流式細胞儀檢測BM-MSCs免疫表型。(2)應用Real-time PCR和Western blot檢測BM-MSCs成脂誘導分化過程中Notch信號和自噬水平的表達變化情況。(3)篩選不同濃度Notch信號抑制劑DAPT（0μM、2.5μM、5μM和10μM）對BM-MSCs中Notch信號表達抑制情況

5、。(4)在BM-MSCs成脂誘導分化過程中，加用Notch信號抑制劑DAPT(5μM)，通過油紅O染色和Real-time PCR檢測成脂相關基因PPARγ和C/EBPα mRNA表達變化，評價抑制Notch信號對BM-MSCs成脂分化能力的影響。(5)應用自噬抑制劑3-MA(5 mM)或氯喹(20μM)抑制BM-MSCs分化早期自噬發(fā)生，同時單用或聯合應用DAPT，驗證自噬發(fā)生對DAPT促BM-MSCs成脂分化能力產生影響。(6)采用

6、Western blot檢測BM-MSCs成脂分化過程中PI3K/Akt/mTOR信號通路中相應蛋白表達變化情況。(7)應用MDC染色、透射電鏡和Western blot聯合檢測，探討Notch信號抑制劑DAPT是否通過PI3K/Akt/mTOR信號對BM-MSCs自噬發(fā)生產生影響。(8) Western blot方法和共聚焦染色方法檢測自噬抑制劑3-MA（5mM）或氯喹(20μM)對DAPT促BM-MSCs自噬發(fā)生的逆轉作用。

7、　　結果:(1)成功分離培養(yǎng)獲得高純度的人BM-MSCs，正常BM-MSCs細胞形態(tài)呈長梭形或多角形，旋渦狀生長;具有成脂誘導分化和成骨誘導分化能力;流式細胞儀檢測BM-MSCs免疫表型，其高表達CD44、CD73、CD90、CD05和CD166，不表達CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。(2) BM-MSCs在成脂誘導培養(yǎng)體系中誘導分化14天，Notch受體NOTCH1、NOTCH2和NOTCH3 mRNA明顯降低(

8、P＜0.05)，NOTCH4mRNA有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);Notch配體DLL1、DLL3、DLL4、DLK1和DLK2 mRNA表達明顯下降(P＜0.05)，Jagged1和Jagged2 mRNA無明顯變化(P＞0.05);Notch信號依賴的轉錄因子HEY1下降明顯(P＜0.05)，HES1和HEY2無明顯變化(P＞0.05)。(3)在BM-MSCs成脂誘導分化早期，自噬相關蛋白LC-3和Beclin1表達量

9、顯著升高，表明在分化早期自噬水平增加，隨著BM-MSCs成脂誘導時間延長，自噬水平逐漸降低。(4)5μMDAPT能夠有效抑制BM-MSCs中Notch信號的表達。(5) BM-MSCs成脂誘導分化過程中，單獨加入Notch信號抑制劑DAPT(5μM)，或聯合應用自噬抑制劑3-MA(5mM)或氯喹(20μM)，通過油紅O染色和成脂相關基因PPARγ和C/EBPα mRNA檢測證實，DAPT可能通過激活自噬發(fā)生而促進BM-MSCs成脂誘導分

10、化。(6)PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路在BM-MSCs成脂誘導分化過程中伴隨成脂誘導進程發(fā)生時間相關性改變。(7) Notch抑制劑DAPT通過作用于PTEN-PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導BM-MSCs自噬的發(fā)生。
　　結論:BM-MSCs成脂誘導分化過程中Notch信號表達降低，而細胞自噬水平在BM-MSCs成脂誘導分化早期激活;Notch信號抑制劑DAPT能夠促進BM-MSCs成脂誘導分化，而抑制分化早期

11、自噬的發(fā)生能夠逆轉DAPT的促成脂作用;DAPT抑制Notch信號通過作用于PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路激活BM-MSCs自噬發(fā)生從而促進其成脂分化。
　　第二部分:半乳糖凝集素在人臍帶間充質干細胞成脂分化和成骨分化達變化
　　間充質干細胞(mesenchmal stem cells，MSCs)因其具有自我更新和多向分化潛能而被廣泛應用于組織損傷修復和再生醫(yī)學臨床應用中。MSCs來源十分廣泛，可從骨髓、脂肪、臍帶

12、和胎盤等眾多組織中分離獲得，其中人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)因其具有取材容易，體外擴增快且不涉及倫理問題等特點受到更多關注。成脂分化和成骨分化作為MSCs主要的分化方向，對于探索MSCs功能試驗和臨床研究具有重要意義。半乳糖凝集素（Galectins）作為β-半乳糖苷結合凝集素家族中的一員在調控細胞免疫、抗原識別、神經發(fā)生和血管生成中具有重

13、要作用，最新研究認為家族中某些亞型參與了細胞分化和脂肪細胞生成，但是目前對于Galectins在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化中的作用尚不明確。
　　目的:檢測Galectins家族成員在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中的表達變化情況，為進一步研究hUC-MSCs分化功能提供一定的理論基礎。
　　方法:(1)分離提純人臍帶間充質干細胞，通過流式細胞儀檢測其間充質干細胞免疫表型，油紅O染色、Von Kossa染色和

14、茜素紅染色觀察其成脂分化和成骨分化能力，鑒定分離的hUC-MSCs;(2) RT-PCR半定量檢測hUC-MSCs內Galectins各成員(Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-12、Gal-13和Gal-14)表達變化情況，篩選出其高表達亞型;(3)Real-time PCR檢測hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中不同時間段（第0天、1天、3天、7天、14天和2

15、1天）Gal-1、Gal-3、Gal-8和Gal-9 mRNA表達變化情況;(4)收集hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中不同時間段細胞培養(yǎng)上清，通過ELISA檢測Gal-1和Gal-9分泌蛋白表達。
　　結果:(1)所分離hUC-MSCs高表達D29、CD73、CD90、CD105、CD44、CD166和HLA-ABC，不表達CD14、CD31、CD45、CD133和HLA-DR，且在體外誘導條件下，具有向脂肪細胞和成骨細胞

16、成分化能力。(2) hUC-MSCs細胞表達Galectins家族中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-8、Gal-9、Gal-10、Gal-12和Gal-13亞型，其中Gal-1、Gal-3、Gal-8和Gal-9 mRNA表達量較高。(3)Gal-1 mRNA和Gal-9 mRNA在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過程中隨誘導時間進程逐漸降低;而Gal-3mRNA和Gal-8 mRNA在hUC-MSCs成脂分化和成骨分化過