CKIP-1負(fù)控間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一類廣泛存在于出生后機(jī)體多種組織的多能干細(xì)胞,較少涉及到諸如胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)問題。一般認(rèn)為在適合條件下,MSCs可以分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。近些年來又發(fā)現(xiàn)了MSCs的一些新功能,例如支持造血、抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)等。不僅如此,一些基于MSCs的細(xì)胞療法已經(jīng)展開嘗試和應(yīng)用,并取得了良好的進(jìn)展。
　　目前肥胖、糖尿病以及其他代謝性疾病已經(jīng)成為世界范圍

2、內(nèi)的首要健康威脅,這些疾病與脂肪細(xì)胞的發(fā)育和功能異常有著非常密切的聯(lián)系。成脂分化是MSCs多向分化的重要組成部分,這一過程受到復(fù)雜而又精密的調(diào)控。簡而言之,MSCs受到外界成脂分化信號刺激后,會(huì)激活一系列關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),而這些轉(zhuǎn)錄因子繼而轉(zhuǎn)錄出大量脂肪細(xì)胞特異的基因來執(zhí)行特化的功能,最終完成MSCs向成熟脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。目前認(rèn)為,C/EBPα和PPARγ是成脂分化中的最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,對它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究有重要的意義。
　　

3、CKIP-1是我們實(shí)驗(yàn)室開展研究多年的基因,其蛋白產(chǎn)物N端含有PH結(jié)構(gòu)域,C端含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,認(rèn)為其主要定位在細(xì)胞近質(zhì)膜區(qū)。近年來我們實(shí)驗(yàn)室建立了ckip-1-/-小鼠模型,并在體內(nèi)水平證明CKIP-1可以增強(qiáng)泛素連接酶Smurf1的活性,抑制成骨前體細(xì)胞的分化和礦化能力。因?yàn)镸SCs是成骨、成脂前體細(xì)胞的共同干祖細(xì)胞,所以我們在本論文中利用敲除小鼠模型來探討CKIP-1缺失對MSCs成脂分化的影響。
　　我們采用了從密質(zhì)骨

4、中分離MSCs的方法,得到了表面抗原均一的高純度ckip-1+/+和ckip-1-/-MSCs,并進(jìn)行了相關(guān)干細(xì)胞性能驗(yàn)證。在隨后的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn):
　　1.ckip-1-/-小鼠MSCs成脂分化能力增強(qiáng),關(guān)鍵標(biāo)志物(marker)基因表達(dá)水平顯著升高,其中C/EBPα尤為明顯,而且這種升高早在轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)發(fā)生。我們首先發(fā)現(xiàn)CKIP-1蛋白表達(dá)在MSCs成脂分化中發(fā)生明顯變化,隨后在比較ckip-1+/+和ckip-1-/-MSC

5、s成脂分化能力時(shí)發(fā)現(xiàn),ckip-1-/-MSCs中出現(xiàn)的脂肪細(xì)胞顯著增多。在將不同培養(yǎng)代數(shù)的ckip-1+/+和ckip-1-/-MSCs進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)時(shí),我們發(fā)現(xiàn)ckip-1-/-MSCs顯示出更高水平的成脂marker基因表達(dá),其中C/EBPα最為顯著。而且通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),我們證明了過表達(dá)CKIP-1也可以抑制C/EBPα的下游效應(yīng)。
　　2.首次證明生理狀態(tài)下CKIP-1可以定位在細(xì)胞核中,并與C/EBPα的轉(zhuǎn)錄抑制因子

6、——組蛋白去乙酰化酶HDAC1存在相互作用。目前對C/EBPα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制了解得比較清楚的是:成脂分化啟動(dòng)后,其他兩個(gè)C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員C/EBPβ與δ會(huì)結(jié)合在C/EBPα的啟動(dòng)子區(qū)激活其轉(zhuǎn)錄,而組蛋白去乙?；窰DAC1作為轉(zhuǎn)錄共抑制子,也會(huì)被招募到該區(qū)域。HDAC1會(huì)降低組蛋白H3及H4乙?；?延緩遲滯RNA聚合酶II對C/EBPα的轉(zhuǎn)錄。我們的數(shù)據(jù)表明CKIP-1可以和上述蛋白復(fù)合體中的HDAC1共定位在MSCs的細(xì)

7、胞核,并與HDAC1發(fā)生內(nèi)源、外源相互作用,且這種相互作用不需要借助其他分子。
　　3.CKIP-1可以增強(qiáng)HDAC1與C/EBPα啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,從而抑制C/EBPα的轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)與脂肪前體細(xì)胞系不同,在MSCs中HDAC1組成型結(jié)合于C/EBPα的啟動(dòng)子區(qū),而非被招募;在成脂分化初期,HDAC1與該區(qū)結(jié)合能力減弱,從其上發(fā)生解離。與ckip-1+/+MSCs相比,在ckip-1-/-MSCs中,成脂分化啟動(dòng)后結(jié)合在該啟動(dòng)子區(qū)

8、的HDAC1顯著減少,相應(yīng)地,結(jié)合在該區(qū)的Ac-H3與RNA聚合酶II顯著增多。過表達(dá)CKIP-1可以減弱HDAC1與該啟動(dòng)子區(qū)的解離,這證明CKIP-1確實(shí)可以通過增強(qiáng)HDAC1與該啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力來抑制C/EBPα的轉(zhuǎn)錄。
　　4.在高脂飲食下,ckip-1-/-小鼠體重增長比ckip-1+/+小鼠更為顯著。經(jīng)過脂肪含量60％的飼料喂養(yǎng)后,ckip-1-/-小鼠體內(nèi)主要的脂肪團(tuán)質(zhì)量以及瘦素水平也顯著高于ckip-1+/+小鼠

9、,并顯示出更為嚴(yán)重的脂肪肝表型。
　　綜上,我們發(fā)現(xiàn)了CKIP-1基因的另一新功能——抑制MSCs成脂分化,并首次揭示了其在生理?xiàng)l件下的核定位。近期本實(shí)驗(yàn)室與中國航天員訓(xùn)練科研中心的合作研究也顯示CKIP-1可以抑制心肌肥大,再聯(lián)系到前期CKIP-1抑制成骨細(xì)胞分化的結(jié)果,我們認(rèn)為CKIP-1是一個(gè)廣譜系抑制干祖細(xì)胞分化的基因。此外,對成脂分化而言,前期的認(rèn)識大多來自脂肪前體細(xì)胞系中(如3T3-L1)。我們通過基因敲除小鼠的模型,

10、揭示了CKIP-1可以增強(qiáng)HDAC1對C/EBPα的轉(zhuǎn)錄抑制而負(fù)調(diào)控MSCs的成脂分化,并發(fā)現(xiàn)在MSCs中,HDAC1對C/EBPα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有自身的特點(diǎn),這些工作都豐富了對成脂分化中C/EBPα轉(zhuǎn)錄調(diào)控的認(rèn)識。
　　另外,我們在實(shí)驗(yàn)中還得到了一些意外的發(fā)現(xiàn)。雖然小鼠作為應(yīng)用最為廣泛的模式生物,但是依照傳統(tǒng)方法從骨髓中分離MSCs存在著許多困難。近些年來有研究者指出小鼠長骨密質(zhì)骨是MSCs的一個(gè)重要來源,并發(fā)展出全新的分離方法,

11、而且有數(shù)據(jù)表明這種方法可以分離到比骨髓中更多更純的MSCs。根據(jù)已有認(rèn)識,密質(zhì)骨也存在于頂骨。應(yīng)用相似的方法,我們從小鼠頂骨密質(zhì)骨中也分離到了與長骨來源的MSCs細(xì)胞形態(tài)、表面抗原都高度相似的細(xì)胞。盡管如此,我們發(fā)現(xiàn)頂骨來源的這些細(xì)胞內(nèi)成骨轉(zhuǎn)錄因子osterix表達(dá)遠(yuǎn)高于長骨來源的MSCs。隨后我們將這兩種不同骨來源的細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。與長骨來源的MSCs可以輕易分化為脂肪細(xì)胞不同,頂骨來源的細(xì)胞喪失了成脂分化的能力。與這一表型相

12、一致,成脂分化的marker基因如PPARγ、C/EBPα及aP-2mRNA水平在頂骨來源的細(xì)胞中遠(yuǎn)低于長骨來源的MSCs。而對于成骨分化而言,經(jīng)過誘導(dǎo)后,頂骨來源的細(xì)胞中成骨分化的marker基因如Runx2,osterix及osteocalcin mRNA水平顯著高于長骨來源的MSCs,并展示出顯著增強(qiáng)的分化活性及礦化細(xì)胞外基質(zhì)的能力。這些數(shù)據(jù)說明了這群頂骨來源的細(xì)胞更像是分化命運(yùn)已經(jīng)決定的祖細(xì)胞(committed progeni