IGFBP4在大腸癌細(xì)胞中對(duì)Wnt-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控作用的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，大腸癌是危害人類健康的常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均占第二位，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。近年來(lái)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。IGFBP4(Insulin Like Growth Factor Binding Protein4)，即胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4，是一種分泌型蛋白，其在多種正常組織中均有表達(dá)，但在大部分腫瘤中呈低表達(dá)，如腎癌、大腸癌、乳腺癌等。IGFBP4可通過(guò)調(diào)控IGF

2、s信號(hào)系統(tǒng)和其它信號(hào)系統(tǒng)，影響細(xì)胞的增長(zhǎng)，但后者鮮見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP4可以通過(guò)與Wnt受體Frizzled8(Frz8)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制Wnt與其受體結(jié)合活性，從而使經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活；在腎癌中 IGFBP4也可以通過(guò)調(diào)控經(jīng)典 Wnt/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮作用，但在大腸癌中未見報(bào)道。目前研究已經(jīng)表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，而該通路的異常激活可以介

3、導(dǎo)大腸腺瘤的癌變。本課題組在前期病理組織學(xué)水平研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP4蛋白表達(dá)水平在大腸正常粘膜、異型增生管狀腺瘤和腺癌中依次降低，并與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子呈負(fù)相關(guān)，提示IGFBP4與Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能存在一定的調(diào)控作用，因此為進(jìn)一步探討IGFBP4與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選取大腸癌細(xì)胞株，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)、Real time-PCR及West

4、ern blot方法，在細(xì)胞水平上探討在大腸癌細(xì)胞中IGFBP4是否對(duì)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用，進(jìn)而為大腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路。
　　目的：在細(xì)胞水平上探討IGFBP4對(duì)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮怎樣的調(diào)控作用
　　方法：⑴選擇兩株人結(jié)腸癌細(xì)胞株（HT-29和HCT116）進(jìn)行體外培養(yǎng)。HT-29和HCT116細(xì)胞分別用含10％胎牛血清配以105 U/L青霉素、100mg/L

5、鏈霉素的 McCoy′s5A培養(yǎng)基和含10%胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。⑵HCT116和 HT-29細(xì)胞分別于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期給予0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化并收集細(xì)胞。應(yīng)用Western blot技術(shù)分別對(duì)兩株人結(jié)腸癌細(xì)胞中IGFBP4的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，篩選低表達(dá)IGFBP4的細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究的靶細(xì)胞。⑶構(gòu)建人IGFBP4基因的 M90載體質(zhì)粒,瞬

6、時(shí)轉(zhuǎn)染人類結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116,同時(shí)轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。分別檢測(cè)IGFBP4基因上調(diào)后對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路上的相關(guān)因子Wnt2、Frizzled8、β-catenin、TCF-4、CDK2及CyclinB1的影響。⑷轉(zhuǎn)染處理HCT116細(xì)胞48h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染處理后人類結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中IGFBP4及Wnt/β-catenin信號(hào)通路上相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況，采用Odys

7、sey儀器進(jìn)行顯色分析，Bio-LD圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。⑸轉(zhuǎn)染處理HCT116細(xì)胞48h后，應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)HCT116細(xì)胞中IGFBP4的 mRNA水平,采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計(jì)算,計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。⑹應(yīng)用SPSS Statistics19.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x?s)表示，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

8、　結(jié)果：①對(duì)HCT116和HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞中IGFBP4的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩株細(xì)胞均表達(dá)IGFBP4，但HCT116細(xì)胞IGFBP4表達(dá)水平最低。因此，選擇HCT116細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。②于轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)綠色熒光蛋白GFP檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。③Real-time PCR結(jié)果顯示，與NC質(zhì)粒對(duì)照組相比，IGFBP4的表達(dá)在HCT116細(xì)胞IGFBP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中顯著升高。Western blot結(jié)

9、果同樣表明， IGFBP4蛋白的表達(dá)在IGFBP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯高于NC對(duì)照組細(xì)胞。以上結(jié)果表明所用IGFBP4質(zhì)?？梢杂行险{(diào)IGFBP4的表達(dá)。④于轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，檢測(cè) IGFBP4質(zhì)粒干擾對(duì)體外培養(yǎng)HCT116細(xì)胞內(nèi)Wnt2和Frizzled8的影響。Western blot結(jié)果顯示，與NC對(duì)照組相比，Wnt2和Frizzled8蛋白的表達(dá)水平在IGFBP4轉(zhuǎn)染組沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)；提示IGFBP4不參與調(diào)控Wn

10、t2和Frizzled8的表達(dá)。⑤于轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，檢測(cè)IGFBP4質(zhì)粒干擾對(duì)信號(hào)通路下游分子β-catenin、TCF-4、CDK2及CyclinB1的影響程度。Western blot結(jié)果顯示，與NC對(duì)照組相比，β-catenin、TCF-4、CDK2及CyclinB1的蛋白的表達(dá)水平均有所降低（P<0.05），提示IGFBP4可以調(diào)控β-catenin、TCF-4、CDK2及CyclinB1的表達(dá)。
　　結(jié)論：IGF