自身免疫甲狀腺炎患者甲狀腺細胞DNA甲基化-羥甲基化的改變及碘的影響.pdf

1、目的:流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)高碘使自身免疫甲狀腺炎(Autoimmune Thyroiditis，AIT)的患病率和發(fā)病率升高，高碘作為促進AIT的重要環(huán)境因素，可能是通過表觀遺傳學機制發(fā)揮促進疾病的作用的。本研究擬從表觀遺傳學的角度，以DNA甲基化和羥甲基化為切入點，從DNA整體甲基化/羥甲基化、特定基因（ICAM1）啟動子區(qū)域DNA甲基化/羥甲基化、全基因組DNA甲基化譜三個層面，觀察甲狀腺細胞DNA修飾異常，并探究這些異常修飾在AIT中

2、的作用。在體內(nèi)、體外實驗中，研究高碘對甲狀腺細胞DNA甲基化/羥甲基化的影響。
　　研究方法:1.本研究納入35例女性AIT患者和35例性別年齡匹配的正常對照(NC)，收集研究對象術(shù)前盤清和甲狀腺標本，采用等密度梯度離心法分離甲狀腺細胞，流式細胞術(shù)染色Tg檢測分離純度。分離純度大于80％的甲狀腺細胞，提取DNA和RNA，用于檢測DNA整體甲基化/羥甲基化、特定基因(ICAM1)啟動子區(qū)域DNA甲基化/羥甲基化。納入4名女性AIT和

3、4名性別年齡匹配的NC，原代培養(yǎng)分離純化甲狀腺細胞，免疫熒光鑒定細胞Tg表達陽性率，純度大于90％的用于DNA甲基化芯片檢測。2.Real-time PCR方法檢測ICAM1 mRNA表達;采用EpiMark試劑盒，通過糖基化和MspⅠ/HpaⅡ酶消化，分辨DNA甲基化和羥甲基化，檢測ICAM1基因啟動子區(qū)域DNA甲基化和羥甲基化水平，檢測位點分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點（Transcription Start Site，TSS）上游-937

4、bp、-701 bp、-226 bp、-65 bp處;焦磷酸測序?qū)CAM1基因DNA甲基化水平進行驗證，檢測位點分別為TSS上游-708 bp、-701 bp、-692 bp、-690 bp、-688 bp和-226bp處。2.利用Epigentek的ELISA試劑盒，檢測DNA整體甲基化和羥甲基化水平;Real-time PCR檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNA羥甲基化酶TET1、TET2、TET3的

5、mRNA表達。3.另外納入的4例女性AIT患者和4例性別年齡匹配的正常對照，提取DNA，利用Infinium Methylation EPIC BeadChip850K芯片檢測全基因組DNA甲基化譜的改變，得到DNA甲基化差異基因后進行GO分析和KEGG通路分析。4.使用無血清培養(yǎng)基、或濃度為1000U/ml的IFN-γ、或800μM羥基戊二酸(2-HG，DNA整體羥甲基化競爭性抑制劑)、或二者共同處理正常人甲狀腺細胞系Nthy-ori

6、3-1。ELISA法檢測DNA整體羥甲基化水平，驗證2-HG抑制羥甲基化的作用;檢測IFN-γ對原代培養(yǎng)甲狀腺細胞和Nthy-ori3-1細胞系DNA整體羥甲基化的影響。Real-time PCR檢測各條件處理后ICAM1基因和IL6基因mRNA表達，流式細胞術(shù)檢測甲狀腺細胞表面ICAM1蛋白水平，ELISA法檢測細胞上清中IL6水平。5.為研究高碘在體內(nèi)對甲狀腺細胞DNA甲基化和羥甲基化的影響，本研究將4周齡NOD.H-2h4小鼠分為

7、高碘水喂養(yǎng)8周組(n=20)和正常對照組(n=20)，甲狀腺HE染色確定建模成功后，提取甲狀腺組織DNA和RNA，檢測ICAM1啟動子區(qū)域TSS上游＃1（-546bp）、＃2(-428bp)、＃3（-246bp、-232bp）、＃4（-107bp、-84bp、-60bp）4個區(qū)域7個位點的甲基化與羥甲基化水平，ELISA檢測DNA整體羥甲基化水平，Real-time PCR檢測ICAM1、TET1、TET2、TET3基因mRNA表達。6

8、.使用不同濃度的碘在體外處理原代培養(yǎng)的甲狀腺細胞和Nthy-ori3-1細胞系，檢測ICAM1基因表達和DNA甲基化/羥甲基化、DNA整體羥甲基化水平及相關(guān)酶的mRNA表達。
　　研究成果:1.在AIT患者甲狀腺細胞中，觀察到ICAM1 mRNA表達升高，TSS上游-937 bp和-226bp的5-hmc水平在AIT組高于對照組，-937 bp、-701 bp、-226bp處5-mc水平在AIT組低于對照組，P＜0.05;相關(guān)分析

9、發(fā)現(xiàn)AIT患者甲狀腺細胞ICAM1基因啟動子區(qū)域甲基化水平與mRNA表達呈負相關(guān)。2.DNA整體甲基化/羥甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，DNA整體甲基化在AIT組和NC組甲狀腺細胞中無差異，DNA整體羥甲基化在AIT組降低，P＜0.05;甲基化/羥甲基化相關(guān)酶mRNA表達未見明顯改變。3.DNA甲基化芯片共檢測866，895個CpG位點。計算分布在各個DNA元件上的比例，發(fā)現(xiàn)Upstream2000、CpG島甲基化低于20％的CpG位點比例增加;內(nèi)

10、含子、重復(fù)序列區(qū)域，DNA甲基化水平低于20％的CpG位點比例增加，同時DNA甲基化水平高于70％的位點比例也增加。差異DNA甲基化位點的分析，設(shè)置P＜0.05、β差值大于0.2的位點為差異位點，發(fā)現(xiàn)32，837個低甲基化位點和61，990個高甲基化位點。低甲基化位點對應(yīng)的基因包括HLA-DQA1等已知在AIT患者甲狀腺高表達的免疫相關(guān)基因，高甲基化基因包括與甲狀腺細胞發(fā)育和甲狀腺激素合成密切相關(guān)的基因，如PAX5、PAX8、PAX9、

11、DUOX1等。高甲基化和低甲基化基因涉及的主要分子功能都包括蛋白結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等;主要位于細胞膜。低甲基化基因參與的生物學過程包括T細胞活化、免疫應(yīng)答、NF-kappaB通路、IFN-γ信號通路;高甲基化的基因涉及的生物學功能有甲狀腺細胞發(fā)育、甲狀腺激素合成等。KEGG通路分析還發(fā)現(xiàn)，低甲基化基因主要涉及細胞黏附功能、NF-kappaB通路等，并發(fā)現(xiàn)多個基因與1型糖尿病相關(guān);高甲基化基因所在的主要細胞通路主要有T細胞受體活化通路、Erb

12、B信號通路、FoxO信號通路、AMPK信號通路等。4.體外實驗發(fā)現(xiàn)，DNA整體羥甲基化在2-HG的抑制作用下約降低了50％，P＜0.05; IFN-γ刺激甲狀腺細胞未改變甲狀腺細胞DNA整體羥甲基化水平。2-HG單獨作用不能提高ICAM1和IL6基因的表達，但可以促進IFN-γ作用下甲狀腺細胞的IL-6、ICAM1基因表達的升高，提示DNA整體羥甲基化水平降低促進甲狀腺細胞的炎癥反應(yīng)。5.以高碘促NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎模型研究高

13、碘對甲狀腺DNA甲基化/羥甲基化的影響，發(fā)現(xiàn)AIT組小鼠甲狀腺組織炎癥相關(guān)分子ICAM1、IL-6、CD40的mRNA表達水平升高，ICAM1基因啟動子區(qū)域＃2和＃3區(qū)域羥甲基化水平有升高趨勢，甲基化水平有降低趨勢。DNA整體羥甲基化水平在AIT組小鼠甲狀腺組織中低于NC組，P＜0.05; TET酶mRNA表達的改變無統(tǒng)計學意義。6.在高碘作用于甲狀腺細胞的體外實驗中發(fā)現(xiàn)，高碘可以刺激AIT患者來源的原代培養(yǎng)甲狀腺細胞ICAM1基因表達

14、升高，但不增加來源于NC組的原代培養(yǎng)甲狀腺細胞和Nthy-ori3-1細胞系ICAM1基因表達。梯度濃度高碘處理使DNA整體羥甲基化都有一過性升高，24小時DNA整體羥甲基化水平開始降低;而10mM、100mM碘化鈉處理24小時，DNA整體羥甲基化仍維持在較高水平，原代培養(yǎng)的甲狀腺細胞中在1mM碘處理24小時后，DNA整體羥甲基化水平也有不同程度的升高。
　　結(jié)論:1.在AIT患者甲狀腺細胞高表達的ICAM1基因啟動子區(qū)域觀察到了

15、DNA羥甲基化水平升高和甲基化水平降低，并發(fā)現(xiàn)甲基化水平與mRNA表達水平呈負相關(guān)。2.AIT患者甲狀腺細胞DNA整體甲基化水平與對照組相比沒有顯著變化，整體羥甲基化水平降低;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA羥甲基化酶(TET1/2/3)表達水平在AIT患者中未見明顯改變。3.AIT患者甲狀腺細胞甲基化譜與對照組相比，啟動子上游2000bp范圍內(nèi)、CpG島低甲基化位點比例增加，內(nèi)含子區(qū)域低甲基化和高甲基化位點均增加，甲基化程度在30-70％的位

16、點比例減少;啟動子區(qū)域低甲基化基因與T細胞活化、免疫應(yīng)答、細胞間黏附、NF-kappaB通路等功能相關(guān)，高甲基化基因與甲狀腺發(fā)育、甲狀腺激素產(chǎn)生等功能相關(guān)。4.體外實驗降低DNA整體羥甲基化水平，能夠促進IFN-γ刺激甲狀腺細胞的炎癥反應(yīng)，協(xié)同刺激ICAM1和IL6的表達水平升高。5.0.05％NaI高碘水喂養(yǎng)8周的NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織DNA整體羥甲基化水平降低。6.高碘組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織ICAM1 mRNA

17、表達水平升高，啟動子區(qū)域可觀察到DNA甲基化水平降低和羥甲基化水平升高。7.高碘處理AIT患者來源的原代培養(yǎng)甲狀腺細胞，可使ICAM1 mRNA表達升高、啟動子區(qū)域DNA羥甲基化水平有升高趨勢，甲基化水平有降低趨勢;但高碘不能增加非AIT患者來源的原代培養(yǎng)甲狀腺細胞和Nthy-roi3-1細胞系ICAM1基因的表達。8.高碘體外處理原代培養(yǎng)甲狀腺細胞升高DNA整體羥甲基化水平，處理Nthy-roi3-1細胞系使DNA整體羥甲基化水平一過