基于DNA雜交鏈反應放大策略的DNA甲基化轉移酶活性及羥甲基化程度電化學分析.pdf

1、DNA甲基化是目前研究最多的DNA表觀遺傳修飾之一。DNA甲基化由DNA甲基轉化移酶催化完成的。由于DNA甲基化狀態(tài)是可被逆轉的，也就是存在DNA去甲基化過程，但相對于甲基化過程，去甲基化過程更加復雜。DNA的甲基化與去甲基化這兩個過程相互平衡，維持了DNA甲基化模式的穩(wěn)定。大量研究表明，許多重要的過程如胚胎發(fā)育和細胞周期調控都與甲基化息息相關，而多個癌癥也表現出異常的甲基化模式。因此，發(fā)展簡易、靈敏、準確、可靠的用于定位、定量分析DN

2、A甲基化的方法是至關重要的。相對于其他方法，電化學擁有如檢測時間短、操作簡單、費用低、易于小型化等諸多優(yōu)勢，是一種具有良好發(fā)展前景的分析測試方法。本論文旨在建立某些疾病DNA的電化學、去甲基化程度的電化學檢測方法，為某些疾病的臨床診斷和治療觀察提供準確、快速和靈敏的方法。本論文的主要工作是通過DNA雜交鏈反應，實現DNA甲基化、去甲基化狀態(tài)及DNA甲基化轉移酶的電化學信號放大檢測。
　　1.DNA甲基化轉移酶（MTase）活性與腫

3、瘤發(fā)生，發(fā)展密切相關。本文建立了免標記超結構電化學方法用于信號放大檢測DNA甲基轉移酶活性（例如使用M.SssI甲基化轉移酶）?？刂乒潭ㄔ诮痣姌O上低密度的DNA有利于形成DNA超結構，從而有效地實現信號放大。以RuHex作為電化學信號分子，可以靜電吸附到雙鏈DNA上，實現了免標記的電化學檢測。實驗證明，使用差分脈沖伏安法(DPV)能夠有效的檢測DNA甲基化轉移酶的活性，線性范圍為0.5-120U/mL，信噪比為3時，檢出限為0.025U

4、/mL。此外，在細胞裂解液內依然可以檢測甲基化轉移酶的活性。同時，本文也證實了該方法應用于快速估測和篩選甲基化轉移酶抑制劑，它可以有助于探索與甲基化相關的抗癌藥物。
　　2.DNA去甲基化過程是DNA甲基化的可逆過程，研究發(fā)現，5-甲基胞嘧啶(5mC)在TET酶的催化氧化作用下生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC的發(fā)現為DNA去甲基化研究提供了新的思路。且5hmC在體細胞重編程，胚胎發(fā)育和啟動哺乳動物DNA去甲基化中有重要作

5、用。因此檢測DNA樣品中5hmC的含量是十分必要的。在本文中，我們建立了基于DNA雜交鏈反應(HCR)信號擴增電化學方法用來有效的量化DNA羥甲基化程度。當DNA序列中羥基化的胞嘧啶在UDP-glucose存在下被T4-βGT作用形成5ghmC，并阻礙MspJI識別剪切，經輔助DNA(FcA-S3&S4)雜交作用后，與吸附到DNA鏈上的RuHex形成電子轉移通道，使信號放大。(I2-I0/I1-I0)代表雙鏈DNA羥基化比例，實驗證明，