DNA羧甲基化的分析方法及SD大鼠器官羧甲基化水平的研究.pdf

1、[目的]：
　　建立液相色譜-串聯(lián)質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析組織全基因組羧甲基化水平方法，并用于分析SD大鼠不同器官基因組羧甲基化水平。應用實時熒光定量PCR檢測羥化酶TET1(ten-eleventranslocation)表達水平的改變，尋找基因羧甲基化及羥化酶TET1表達在SD大鼠不同器官組織中的特點和聯(lián)系，為研究基因羧甲基化在表

2、觀遺傳過程的相關機理打下基礎。
　　[方法]：
　　1.組織DNA的提取:按照不同公司的基因組DNA提試劑盒的操作說明分別提取SD大鼠基因組DNA，比較DNA的提取效果，運用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性并用紫外分光光度計進行DNA濃度以及純度的檢測，濃度和純度合格的DNA用于下一步的分析。
　　2.DNA羧甲基化LC-MS/MS分析條件優(yōu)化:提取的DNA通過甲酸水解，并對色譜柱的選擇、流動相的流速、比例、甲酸銨濃度

3、、氨水濃度、質晰參數(shù)等進行優(yōu)化考察。
　　3.基因組羧甲基化的LC-MS/MS分析:提取SD大鼠不同組織的DNA，加入Cyt13C15N2，在氮氣下吹干，加入88％甲酸在140℃反應90min進行水解，氮氣吹干，用流動相復溶后離心，取上清液，用LC-MS/MS進行分析。
　　4.TET1基因引物的設計:參照Genbank已公布的羥化酶TET1基因及內參基因GAPDH的mRNA序列，利用Primer5.0軟件分別設計用于qRT

4、-PCR的引物，通過在線blast工具進行檢測引物的特異性，并運用Oligo7.0軟件分析引物質量，篩選出合適的引物。
　　5.組織RNA的提取:按照天根總RNA提取試劑盒的操作說明提取SD大鼠各組織RNA，運用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用酶標儀對RNA的純度及濃度進行測定。
　　6.TET1表達水平的實時熒光定量PCR分析:取質量符合要求的RNA按照天根cDNA第一鏈合成試劑盒的操作說明進行反轉錄。逆轉錄產物經內

5、參基因擴增檢驗其完整性，以質量符合的cDNA作為模板，熒光定量PCR條件為:95℃，變性，15s;60.0℃，延伸，30s;72.0℃，退火，30s;40個循環(huán)，在延伸階段采集熒光信號，PCR結束后再60～95℃進行熔解曲線分析，最后分析TET1酶的表達水平。
　　[結果]：
　　1.方法優(yōu)化
　　1.1DNA提取:選擇四家公司不同DNA提取試劑盒，比較DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)天根和QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒

6、提取的的DNA條帶單一、清晰、完整性較好，但天根公司的試劑盒性價比更高。
　　1.2色譜條件選擇:通過比較C18柱和HILIC色譜柱對5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytsine，5caC)和胞嘧啶(Cytosine，Cyt)的保留和分離，發(fā)現(xiàn)C18柱對5caC和Cyt沒有保留，而HILIC色譜柱能較好分離5caC和Cyt。并對流動相比例、流動相氨水濃度、水相甲酸銨濃度和洗脫程序進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以7mM甲酸銨，0.1％氨水的水

7、相和0.1％氨水的乙腈為流動相，在梯度洗脫條件下5caC和Cyt能快速分離且峰形較好。
　　1.3質譜條件選擇:通過對5caC、Cyt和Cyt13C15N2進行掃描選擇母離子和優(yōu)化母離子的Fragment電壓和子離子碰撞能量(CE)，發(fā)現(xiàn)5caC的母離子m/z156，子離子（m/z138.1和m/z94.9）;Cyt的母離子m/z112.1，子離子(m/z95.0和m/z69.0);Cyt13C15N2母離子m/z115.1，子離

8、子（m/z97.2和m/z70.2）并在最佳Fragment和CE的條件下，5caC、Cyt和Cyt13C15N2靈敏度較高。
　　2.基因組羧甲基化的LC-MS/MS分析方法驗證:Cyt和5caC的線性范圍分別為(400～4000) ng/mL和(1～100) ng/mL，其相關系數(shù)分別為0.9991和0.9981。Cyt和5caC的LOD分別為0.05 ng/mL和0.1 ng/mL，LOQ分別為0.1ng/mL和0.5ng/

9、mL。Cyt和5caC的日內和日間RSD范圍均在2.63％～6.26％，準確性范圍在85％～105％和精密度RSD分別為3.90％和4.81％，Cyt和5caC加標回收率為86.27％～92.95％。特異性實驗證實Cyt、5mC、5hmC、5fC單個標準或混合標準在酸性加熱條件下沒有生成5caC。
　　3.LC-MS/MS分析不同器官的基因組羧甲基化水甲:以5caC與（5caC和Cyt之和)的摩爾濃度比表示羧甲基化率((x)±s)

10、，結果發(fā)現(xiàn)不同器官的基因組羧甲基化水平范圍在8.70×10-6～2.95×10-5，腦部羧甲基化的水平高于心、肝、肺和腎[(1.06±0.05)×10-5、（0.87±0.16)×10-5、（1.50±0.24)×10-5和（1.28±0.16)×10-5]的羧甲基化水平(p＜0.05)，而腦部的大腦、小腦和腦干[（2.63±0.14）×10-5、（2.51±0.15）×10-5和（2.95±0.17）×10-5，n=6]之間沒有顯著性

11、差異(p＞0.05)。
　　4.羥化酶TET1表達水平的實時熒光定量PCR分析:通過測定SD大鼠不同器官中羥化酶TET1表達水平，發(fā)現(xiàn)大腦TET1酶的表達高于心、肝、肺和腎[（0.587±0.042）％、（0.608±0.080）％、（0.839±0.035）％和（0.579±0.056）％](p＜0.05)，但腦部的大腦、小腦[（1.030±0.058）％]和腦干[(1.009±0.090)％]之間沒有顯著性差異(p＞0.05)

12、。
　　5.通過雙變量關系統(tǒng)計分析了SD大鼠不同器官羧甲基化水平與TET1酶表達關系，發(fā)現(xiàn)兩者具有正相關關系（r=0.940，p＜0.05）。
　　[結論]：
　　本文通過優(yōu)化dNA提取試劑盒、色譜分離條件及質譜條件。使用甲酸水解DNA，采用HILIC結合液相色譜串聯(lián)質譜首次成功建立了動物基因組羧甲基化水平的分析方法，該方法具有靈敏度高、特異性強、快速簡便的特點。并用該方法成功測定了SD大鼠不同器官組織中DNA羧甲基化