IR-780光熱治療及聲動(dòng)力治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是婦女常見(jiàn)的惡性腫瘤，全國(guó)腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌的主要治療方式是手術(shù)、放療、化療。盡管聯(lián)合治療在腫瘤治療中具有單一治療所不能比擬的優(yōu)勢(shì)，但是，有時(shí)聯(lián)合治療會(huì)增大治療的副作用而使得患者不得不放棄治療。
　　光熱治療(PTT)腫瘤是將光能轉(zhuǎn)化為熱能，加熱病灶部位使溫度達(dá)到臨界治療溫度并維持一段時(shí)間，以殺死癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。光熱治療因其創(chuàng)傷小、副作用少以及高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，從而逐漸得到臨

2、床醫(yī)學(xué)的肯定。R-780碘化物是脂溶性的陽(yáng)離子花青素染料，其最大吸收波長(zhǎng)在780 nm，由于其具有強(qiáng)熒光性、良好的穩(wěn)定性及嗜腫瘤性，已被認(rèn)為是很好的腫瘤活體成像的熒光探針。此外，由于IR-780在近紅外區(qū)有很強(qiáng)的吸收特性，故可被用來(lái)光熱治療。
　　聲動(dòng)力治療(SDT)是近年來(lái)興起的一種新型治療腫瘤的方法，聲動(dòng)力治療的概念首先由日本的科學(xué)家Yumita提出，他們首次證實(shí)了低頻超聲能夠激活光敏劑，產(chǎn)生類似于激光的激活過(guò)程，從而達(dá)到抑制

3、腫瘤生長(zhǎng)效果。聲動(dòng)力治療是聲敏劑選擇性的聚集于腫瘤組織中，通過(guò)超聲輻照，聲敏劑被激活發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。SDT包括三個(gè)組成部分:聲敏劑;超聲;氧氣分子。目前的聲敏劑多來(lái)源于光敏劑，聲敏劑是聲動(dòng)力治療能否成功的關(guān)鍵因素之一。雖然聲動(dòng)力的治療機(jī)制尚未完全闡明，然而，超聲能激活聲敏劑發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)來(lái)引發(fā)腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡。
　　聲動(dòng)力治療類似于光動(dòng)力在治療，但相較于光動(dòng)力治療，聲動(dòng)力治療有兩大明顯優(yōu)勢(shì):(

4、1)超聲波是種機(jī)械波，可以穿過(guò)人體組織到達(dá)深層的腫瘤里。(2)超聲可以聚焦于特定的腫瘤區(qū)域從而有效的激活聲敏劑。許多光敏劑可以作為聲敏劑進(jìn)行SDT，像卟啉和卟啉類衍生物等，這些分子不僅在PDT顯示治療效果同時(shí)在SDT中也有著明顯的殺傷作用。鑒于光敏劑和聲敏劑的吸收波長(zhǎng)都很長(zhǎng)，都可以在光照條件下被激活等共性，本實(shí)驗(yàn)的假設(shè)IR-780碘化物可以被超聲激活進(jìn)行SDT實(shí)驗(yàn)。
　　第一章 IR-780光熱治療小鼠乳腺癌移植瘤的初步研究

5、>　　目的:
　　研究IR-780光熱治療(PTT)對(duì)小鼠乳腺癌的治療效果。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　IR-780碘化物，二甲基亞砜(DMSO)。稱取一定量的IR-780溶于DMSO中，使其濃度為32 mg/ml，再用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，終濃度為800μg/ml，備實(shí)驗(yàn)使用。單步法測(cè)凋亡（TUNEL）檢測(cè)試劑盒。
　　激光器;Vevo2100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像儀;倒置熒光顯微鏡;石蠟切片機(jī)

6、。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　在Balb/c小鼠右側(cè)腹部皮下接種4T1乳腺癌細(xì)胞建立荷瘤動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，待腫瘤長(zhǎng)到500mm3時(shí)，隨機(jī)將荷瘤小鼠分為四組，①對(duì)照組:瘤內(nèi)注射0.1ml生理鹽水;②激光組:瘤內(nèi)注射0.1ml生理鹽水后行激光照射(2.2 W/cm2，4 min);③IR-780組:瘤內(nèi)注射0.1ml即80μg IR-780溶液;④IR-780+激光組:瘤內(nèi)注射80μg IR-780溶液后行激光照射(2.2 W/cm

7、2，4 min)。游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄腫瘤大小，采用Vevo2100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像儀對(duì)四組小鼠給藥后0h、12h以及60 h時(shí)的腫瘤影像進(jìn)行成像并采圖，并對(duì)60 h后處死小鼠獲取的腫瘤組合采用免疫組化方法TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察各組腫瘤組織凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　在治療60 h后，IR-780+激光組腫瘤體積相較于IR-780組明顯減小(P＜0.01)，其余三組腫瘤體積無(wú)明顯差異。在超聲圖上，IR-780+激光照射12

8、h后腫瘤開(kāi)始明顯變小，超聲回聲稍有減低(P＜0.05);60 h后腫瘤明顯變小，回聲明顯減低(P＜0.01)。對(duì)照組、激光組、IR-780組除腫瘤稍有增大外，回聲無(wú)明顯改變。由TUNEL實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)IR-780+激光組腫瘤凋亡明顯增多(P＜0.01)，而其余三組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　IR-780光熱治療對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤具有明顯殺傷作用，表現(xiàn)為腫瘤體積明顯減小，腫瘤回聲明顯減低，大量腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第二章 IR-

9、780聲動(dòng)力治療乳腺癌細(xì)胞學(xué)研究及機(jī)制探討
　　目的:
　　研究IR-780聲動(dòng)力治療(sonodynamic therapy, SDT)治療乳腺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)及機(jī)制研究。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　IR-780碘化物;二甲基亞砜(DMSO)。稱取一定量的IR-780溶于DMSO中，使其濃度為10mM，再用胎牛血清稀釋，終濃度為100μM備實(shí)驗(yàn)使用。細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒;凋亡試劑盒;單線態(tài)氧試劑

10、盒;過(guò)氧化氫基團(tuán)檢測(cè)試劑盒;羥基檢測(cè)試劑盒。
　　超聲治療儀;FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀;Accuri流式細(xì)胞儀;多功能酶標(biāo)儀;Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　通過(guò)FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)4T1乳腺癌腫瘤細(xì)胞在不同濃度的IR-780碘化物條件下，孵育不同時(shí)間時(shí)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況。采用CCK-8方法檢測(cè)不同超聲輻照時(shí)間(0s、20 s、40 s)及不同IR-780碘化物

11、濃度對(duì)小鼠4T1乳腺癌腫瘤細(xì)胞存活率的影響。通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IR-780聲動(dòng)力治療4T1細(xì)胞后凋亡壞死的比率，單線態(tài)氧試劑盒、過(guò)氧化氫基團(tuán)檢測(cè)試劑盒、羥基檢測(cè)試劑盒檢測(cè)自由基1O2、H2O2和·OH，探討IR-780聲動(dòng)力治療的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、4T1細(xì)胞攝取IR-780碘化物有明顯的劑量和時(shí)間依賴性，藥物濃度為4μM、10μM、16μM在孵育時(shí)間1h、2h、3h時(shí)，同一藥物濃度，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的熒光

12、強(qiáng)度增加。
　　2、在無(wú)超聲輻照時(shí)，4μM、10μM和16μM碘化物濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞活性有輕微的抑制效應(yīng)。在單獨(dú)超聲輻照時(shí)間為20 s時(shí)，其對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有明顯的影響，但延長(zhǎng)超聲作用時(shí)間為40 s時(shí)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞活性有一些抑制的影響。當(dāng)IR-780碘化物聯(lián)合超聲輻照時(shí)，腫瘤細(xì)胞的活性受到明顯的生長(zhǎng)抑制，且更高濃度的IR-780碘化物濃度或更長(zhǎng)超聲輻照時(shí)間，呈現(xiàn)出更高對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(P＜0.01)。
　　3、與對(duì)照組相比，

13、IR-780加上超聲可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡/壞死，其細(xì)胞凋亡/壞死在超聲條件不變的情況下與IR-780碘化物濃度正相關(guān)。
　　4、IR-780加超聲輻照組作用于腫瘤細(xì)胞相較于其他組產(chǎn)生顯著的1O2增加(P＜0.01)。IR-780加超聲輻照組H2O2熒光強(qiáng)度相較于其他組最強(qiáng)(P＜0.01)。而在IR-780超聲作用過(guò)程中并沒(méi)有顯著增加·OH自由基(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　IR-780可被4T1細(xì)胞高效攝取，通

14、過(guò)聯(lián)合超聲SDT治療可明顯抑制4T1乳腺癌腫瘤細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡/壞死。同時(shí)可明顯增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)1O2和H2O2的產(chǎn)生。
　　第三章 IR-780聲動(dòng)力治療乳腺癌動(dòng)物模型的抑制效應(yīng)
　　目的:
　　研究IR-780聲動(dòng)力治療(sonodynamic therapy, SDT)治療乳腺癌移植瘤模型的抑制效應(yīng)并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　IR-780碘化物;

15、二甲基亞砜(DMSO)。稱取一定量的IR-780溶于DMSO中，使其濃度為32 mg/ml，再用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，終濃度為800μg/ml備實(shí)驗(yàn)使用。單步法測(cè)凋亡試劑盒;伊紅染色液;蘇木精染色液。
　　超聲治療儀;倒置熒光顯微鏡;正置顯微鏡;小動(dòng)物活體成像儀。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　通過(guò)瘤內(nèi)注射IR-780溶液，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)IR-780在小鼠瘤內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值，確定最佳的超聲輻照時(shí)間。4T1

16、移植瘤小鼠分為PBS組、超聲組、IR-780組、IR-780+超聲組，處理后觀察小鼠腫瘤體積和體重的變化情況，研究IR-780聲動(dòng)力治療體內(nèi)治療效果。腫瘤組織經(jīng)H&E染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化和TUNEL免疫組化檢測(cè)組織凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1、IR-780藥物瘤內(nèi)注射后沿腫瘤組織擴(kuò)散，腫瘤區(qū)域的熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，在藥物注射1h時(shí)通過(guò)熒光圖可見(jiàn)藥物全部覆蓋腫瘤并強(qiáng)度達(dá)高峰。時(shí)間大于6h后，會(huì)有IR-780碘化物滲透到周

17、邊正常組織。藥物注射48 h后，IR-780在腫瘤內(nèi)的含量仍占主導(dǎo)地位，其熒光值明顯高于其他器官組織(P＜0.01)。
　　2、老鼠在IR-780碘化物加上超聲輻照時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)收到明顯的抑制(P＜0.01)。相比之下，IR-780組和單獨(dú)超聲組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照PBS組相比，并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果(P＞0.05)。
　　3、腫瘤切片經(jīng)H&E染色后可觀察到IR-780加超聲輻照后H&E染色顯著增加的細(xì)胞壞死。TUNEL染