四君子湯多糖對IEC-6細胞遷移多胺信號通路鈣離子調控影響的研究.pdf

1、目的:
　　觀察四君子湯多糖對小腸上皮細胞（IEC-6）遷移多胺信號通路Ca2+調控的影響，探討益氣健脾代表方劑四君子湯促進胃腸粘膜損傷修復的作用機制，為其治療胃腸粘膜損傷病變的療效機制研究提供科學依據(jù)。
　　方法:
　　(1)四君子湯多糖提取分離純化:四君子湯經(jīng)水提醇沉、sevag法去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析，分別得到四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖;苯酚-硫酸法檢測3種多糖樣品的多糖含量;HPLC法對四君子

2、湯純化多糖進行純度分析。
　　(2)受試藥篩選及劑量確定:在IEC-6細胞遷移模型下觀察四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖對細胞遷移的影響，篩選出細胞遷移藥效較好的多糖樣品為本研究受試藥。細胞實驗設正常對照組，陽性對照藥精脒組（5μmol·L-1），四君子湯多糖40、80、160mg·L-1組（4-AP負荷實驗設四君子湯多糖20、40、80mg·L-1組）;DFMO或4-AP負荷實驗設正常對照組，DFMO或4-AP模型組，精脒組和受

3、試藥組同時加入DFMO或4-AP。
　　(3)細胞遷移實驗:細胞劃痕損傷法造細胞遷移模型，相差倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況。
　　(4)柱前衍生HPLC法測定細胞內多胺（精脒和精胺）含量。
　　(5)RT-qPCR法檢測Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1mRNA表達。
　　(6)Western Blot法檢測Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表達。
　　(7)流式細胞儀

4、檢測細胞膜電位、[Ca2+]cyt。
　　(8)酶聯(lián)免疫法檢測IP3含量。
　　(9)Pulldown assay法檢測GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表達。
　　(10)免疫熒光法檢測myosinⅡ蛋白表達。
　　結果:
　　(1)四君子湯多糖提取分離純化及藥效追蹤結果:①四君子湯總多糖、粗多糖、純化多糖的得率分別為5.42％、4.19％、2.44％;②四君子湯總多糖、粗多糖、純

5、化多糖的多糖含量分別為67.9％、72.4％、81.6％。③藥效追蹤結果提示四君子湯3種多糖樣品均能促進細胞遷移;因四君子湯純化多糖藥效最佳，故確定其為本研究后續(xù)實驗受試藥，實驗劑量設為20mg·L-1～160 mg·L-1，有效劑量40mg·L-1～160mg·L-1。
　　(2)四君子湯多糖對細胞遷移的影響:能促進細胞遷移，逆轉DFMO（多胺合成抑制劑）負荷所致的細胞遷移抑制;提示四君子湯多糖促進細胞遷移的作用與影響多胺有關。

6、
　　(3)四君子湯多糖對細胞遷移多胺信號通路Ca2+調控上游指標的影響:①能提高細胞內多胺（精脒、精胺）含量，可逆轉DFMO所致的細胞內多胺（精脒、精胺）含量降低。②能提高鉀通道蛋白Kv1.1mRNA和蛋白表達，可逆轉DFMO負荷所致Kv1.1mRNA和蛋白表達抑制;③可逆轉4-AP（鉀通道蛋白抑制劑）負荷所致的細胞遷移、Kv1.1mRNA和蛋白表達抑制;④能提高細胞膜電位以增加細胞膜電位超極化，可逆轉DFMO所致的細胞膜電位去

7、極化。提示四君子湯多糖可通過提高細胞多胺含量、激活鉀通道、增加細胞膜電位超極化，從而提高Ca2+內流驅動力。
　　(4)四君子湯多糖對細胞遷移多胺信號通路Ca2+調控的影響:①能增加細胞內[Ca2+]cyt，可逆轉DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;②能提高鈣通道蛋白TPRC1mRNA和蛋白表達，能逆轉DFMO所致的TPRC1mRNA和蛋白表達抑制;③能提高胞內鈣庫動員指標PLC-γ1mRNA和蛋白表達以及IP3含量，可逆轉DF

8、MO所致的PLC-γ1mRNA和蛋白表達抑制以及IP3含量降低;④若使用無Ca2+培養(yǎng)液以去除細胞外Ca2+，則不但空白對照組出現(xiàn)顯著的細胞遷移抑制，且四君子湯多糖促進細胞遷移的作用也明顯弱于使用含Ca2+培養(yǎng)液時。提示四君子湯多糖可通過促進Ca2+內流和胞內鈣庫動員兩途徑以增加[Ca2+]cyt，又以前者作用更明顯。
　　(5)四君子湯多糖對細胞遷移多胺信號通路Ca2+調控下游靶點的影響:①不但能提高Rho GTPase(Rho

9、A、Rac1、Cdc42)總蛋白表達，逆轉DFMO負荷所致的RhoA、Rac1、Cdc42總蛋白表達抑制;還能提高Rho GTPase激活形式的GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表達;②能提高細胞骨架myosinⅡ蛋白表達，逆轉DFMO所致的myosinⅡ蛋白表達抑制。提示四君子湯多糖可通過作用于Ca2+下游指標如Rho GTPase和myosinⅡ以影響細胞骨架重排而促進細胞遷移。
　　結論：