版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
本論文對(duì)四君子湯多糖進(jìn)行提取、分離純化和初步結(jié)構(gòu)表征,并觀察四君子湯多糖在小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移過程對(duì)多胺信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的影響,探討四君子湯多糖促進(jìn)胃腸粘膜損傷的作用機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。為闡明益氣健脾方劑治療脾虛證的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。
方法:
1.采用水提醇沉法提取四君子湯總多糖、Sevag法去蛋白獲得四君子湯粗多糖;采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱對(duì)四君子湯
2、粗多糖進(jìn)行分離純化,得四君子湯純化后多糖組分(命名為D149)。
2.采用劃痕法復(fù)制IEC-6細(xì)胞遷移模型,對(duì)上述四君子湯多糖各提取分離部位進(jìn)行細(xì)胞遷移藥效篩選,熒光倒置相差顯微鏡觀察各受試藥對(duì)細(xì)胞遷移的影響及D149對(duì)DFMO(多胺合成抑制劑)抑制細(xì)胞遷移的逆轉(zhuǎn)作用。Image pro-Plus6.0軟件對(duì)遷移過劃痕處的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3.高效液相-凝膠滲透色譜法(HPLC-GPC)對(duì)分離純化后具有促進(jìn)細(xì)胞遷移活性
3、的四君子湯多糖組分進(jìn)行純度和分子量檢測(cè),完全酸水解GC-MS法對(duì)其進(jìn)行除果糖以外的單糖分析,完全酸水解HPLC法對(duì)其果糖進(jìn)行檢測(cè),紅外光譜掃描分析(FT-IR)檢測(cè)其官能團(tuán)。采用上述物理化學(xué)手段和波譜數(shù)據(jù)分析對(duì)具有促進(jìn)細(xì)胞遷移活性的四君子湯多糖組分進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)解析。
4.采用熒光染料DiBAC4(3)孵育細(xì)胞遷移過程中的IEC-6細(xì)胞,結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜電位(Em)。
5.采用熒光染料Fluo-3,AM孵育細(xì)胞
4、遷移過程中的IEC-6細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中游離Ca2+水平([Ca2+]cyt),Image pro-Plus6.0軟件分析每張照片的平均熒光強(qiáng)度。
6.熒光定量PCR和Western-blot法分別檢測(cè)細(xì)胞遷移過程中四君子湯多糖對(duì)多胺信號(hào)通路指標(biāo)Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1及Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果:
1.四君子湯藥材經(jīng)過水提醇沉、Sevag法去
5、蛋白、DEAE-52纖維素柱和SephadexG-100凝膠柱層析并超純水洗脫等步驟,對(duì)四君子湯多糖進(jìn)行提取、分離純化后,分別得到的4個(gè)代表性多糖提取物——四君子湯總多糖、四君子湯粗多糖、純化后四君子湯多糖D1和D149,苯酚-硫酸法分光光度計(jì)測(cè)得其糖含量(以葡萄糖計(jì))分別為71.4%、75.5%、81.0%和98.5%,HPLC-GPC測(cè)得D1和D149純度分別為86.43%和98.62%。提示經(jīng)分離純化后,四君子湯多糖的糖含量和純度
6、逐步升高。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四君子湯總多糖、四君子湯粗多糖、D1和D149促進(jìn)細(xì)胞遷移的起效劑量分別為200、100、50和30 mg/L,表明四君子湯多糖經(jīng)分離純化后,促進(jìn)細(xì)胞遷移的藥效活性逐步提高。
2.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得四君子湯多糖組分D149的相對(duì)分子質(zhì)量約為4199,D149中含有大量的葡萄糖、核糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖等單糖,其摩爾比為18.7∶2.1∶1.3∶1.0∶7.4∶6.7,其中葡萄糖含量較大,其次
7、是甘露糖和阿拉伯糖。紅外光譜也顯示D149組分的糖類物質(zhì)特征吸收峰,且證明其中呋喃糖和吡喃糖并存,從而對(duì)四君子湯多糖組分D149進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)表征。
3.四君子湯多糖組分D149(有效劑量30mg/L~120mg/L)促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移的作用機(jī)理:(1)對(duì)鉀離子通道和膜電位的影響:能提高細(xì)胞遷移過程鉀通道蛋白Kv1.1 mRNA和蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞膜電位超極化;能逆轉(zhuǎn)DFMO(多胺合成抑制劑)或4-AP(鉀通道抑制劑)所致
8、的Kv1.1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制,逆轉(zhuǎn)細(xì)胞膜電位的去極化;(2)對(duì)鈣離子及其調(diào)控的影響:能提高細(xì)胞遷移過程[Ca2+]cyt,逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;能提高TRPC1(鈣通道蛋白)和PLC-γ1(胞內(nèi)鈣庫調(diào)節(jié)指標(biāo))mRNA和蛋白表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO所致TRPC1和PLC-γ1mRNA和蛋白表達(dá)抑制;無鈣培養(yǎng)時(shí)可致細(xì)胞遷移抑制,D149可改善無鈣培養(yǎng)所致的細(xì)胞遷移抑制,但不能使細(xì)胞遷移恢復(fù)正常水平,提示其可影響胞外Ca
9、2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+,從而提高細(xì)胞[Ca2+]cyt,又以促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流作用更明顯。(3)對(duì)Rho GTPase的影響:能提高細(xì)胞遷移過程Rho GTPase(RhoA、Rac1和Cdc42)mRNA和蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)DFMO所致的RhoA、Rac1和Cdc42mRNA和蛋白表達(dá)抑制。
結(jié)論:
四君子湯多糖經(jīng)提取純化后,糖含量和純度升高,促進(jìn)細(xì)胞遷移藥效活性也隨之增強(qiáng);分離純化后的四君子湯多糖組分D14
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 四君子湯多糖對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路鈣離子調(diào)控影響的研究.pdf
- 四君子湯
- 加味四君子湯對(duì)mTOR信號(hào)通路調(diào)控的抗衰老機(jī)制研究.pdf
- 黨參和甘草提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移多胺調(diào)控信號(hào)通路作用的研究.pdf
- 加味四君子湯對(duì)嚴(yán)重燙傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響.pdf
- 四君子湯《太平惠民和劑局方》
- 四君子湯對(duì)乳腺癌術(shù)后患者細(xì)胞免疫功能的影響.pdf
- 加味四君子湯對(duì)嚴(yán)重燙傷大鼠中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞凋亡的影響.pdf
- 黃芪多糖通過多胺和鈣離子調(diào)節(jié)IEC-6細(xì)胞遷移的研究.pdf
- “加味四君子湯”抗衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 加味四君子湯對(duì)胃腸黏膜損傷的保護(hù)作用.pdf
- 柴胡疏肝散、四君子湯、柴疏四君子湯作用于肝郁證模型的生物學(xué)基礎(chǔ).pdf
- 加味四君子湯對(duì)仔豬消化機(jī)能的作用機(jī)理研究.pdf
- 加味四君子湯對(duì)燒傷患者腸道功能影響的臨床觀察.pdf
- 加味四君子湯對(duì)仔豬免疫機(jī)能的作用機(jī)理研究.pdf
- 基于SGLT1通路探討四君子湯對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響.pdf
- 添加四君子湯的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)機(jī)械通氣患者的影響.pdf
- 四君子湯對(duì)北京鴨健脾助消化機(jī)理的研究.pdf
- 加味四君子湯的藥效學(xué)及對(duì)仔豬作用機(jī)理的研究.pdf
- 四君子湯對(duì)小鼠神經(jīng)元表達(dá)蛋白質(zhì)組的影響.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論