2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  本論文對(duì)四君子湯多糖進(jìn)行提取、分離純化和初步結(jié)構(gòu)表征,并觀察四君子湯多糖在小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移過程對(duì)多胺信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的影響,探討四君子湯多糖促進(jìn)胃腸粘膜損傷的作用機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。為闡明益氣健脾方劑治療脾虛證的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。
  方法:
  1.采用水提醇沉法提取四君子湯總多糖、Sevag法去蛋白獲得四君子湯粗多糖;采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱對(duì)四君子湯

2、粗多糖進(jìn)行分離純化,得四君子湯純化后多糖組分(命名為D149)。
  2.采用劃痕法復(fù)制IEC-6細(xì)胞遷移模型,對(duì)上述四君子湯多糖各提取分離部位進(jìn)行細(xì)胞遷移藥效篩選,熒光倒置相差顯微鏡觀察各受試藥對(duì)細(xì)胞遷移的影響及D149對(duì)DFMO(多胺合成抑制劑)抑制細(xì)胞遷移的逆轉(zhuǎn)作用。Image pro-Plus6.0軟件對(duì)遷移過劃痕處的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
  3.高效液相-凝膠滲透色譜法(HPLC-GPC)對(duì)分離純化后具有促進(jìn)細(xì)胞遷移活性

3、的四君子湯多糖組分進(jìn)行純度和分子量檢測(cè),完全酸水解GC-MS法對(duì)其進(jìn)行除果糖以外的單糖分析,完全酸水解HPLC法對(duì)其果糖進(jìn)行檢測(cè),紅外光譜掃描分析(FT-IR)檢測(cè)其官能團(tuán)。采用上述物理化學(xué)手段和波譜數(shù)據(jù)分析對(duì)具有促進(jìn)細(xì)胞遷移活性的四君子湯多糖組分進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)解析。
  4.采用熒光染料DiBAC4(3)孵育細(xì)胞遷移過程中的IEC-6細(xì)胞,結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜電位(Em)。
  5.采用熒光染料Fluo-3,AM孵育細(xì)胞

4、遷移過程中的IEC-6細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中游離Ca2+水平([Ca2+]cyt),Image pro-Plus6.0軟件分析每張照片的平均熒光強(qiáng)度。
  6.熒光定量PCR和Western-blot法分別檢測(cè)細(xì)胞遷移過程中四君子湯多糖對(duì)多胺信號(hào)通路指標(biāo)Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1及Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
  結(jié)果:
  1.四君子湯藥材經(jīng)過水提醇沉、Sevag法去

5、蛋白、DEAE-52纖維素柱和SephadexG-100凝膠柱層析并超純水洗脫等步驟,對(duì)四君子湯多糖進(jìn)行提取、分離純化后,分別得到的4個(gè)代表性多糖提取物——四君子湯總多糖、四君子湯粗多糖、純化后四君子湯多糖D1和D149,苯酚-硫酸法分光光度計(jì)測(cè)得其糖含量(以葡萄糖計(jì))分別為71.4%、75.5%、81.0%和98.5%,HPLC-GPC測(cè)得D1和D149純度分別為86.43%和98.62%。提示經(jīng)分離純化后,四君子湯多糖的糖含量和純度

6、逐步升高。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四君子湯總多糖、四君子湯粗多糖、D1和D149促進(jìn)細(xì)胞遷移的起效劑量分別為200、100、50和30 mg/L,表明四君子湯多糖經(jīng)分離純化后,促進(jìn)細(xì)胞遷移的藥效活性逐步提高。
  2.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得四君子湯多糖組分D149的相對(duì)分子質(zhì)量約為4199,D149中含有大量的葡萄糖、核糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖等單糖,其摩爾比為18.7∶2.1∶1.3∶1.0∶7.4∶6.7,其中葡萄糖含量較大,其次

7、是甘露糖和阿拉伯糖。紅外光譜也顯示D149組分的糖類物質(zhì)特征吸收峰,且證明其中呋喃糖和吡喃糖并存,從而對(duì)四君子湯多糖組分D149進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)表征。
  3.四君子湯多糖組分D149(有效劑量30mg/L~120mg/L)促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移的作用機(jī)理:(1)對(duì)鉀離子通道和膜電位的影響:能提高細(xì)胞遷移過程鉀通道蛋白Kv1.1 mRNA和蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞膜電位超極化;能逆轉(zhuǎn)DFMO(多胺合成抑制劑)或4-AP(鉀通道抑制劑)所致

8、的Kv1.1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制,逆轉(zhuǎn)細(xì)胞膜電位的去極化;(2)對(duì)鈣離子及其調(diào)控的影響:能提高細(xì)胞遷移過程[Ca2+]cyt,逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;能提高TRPC1(鈣通道蛋白)和PLC-γ1(胞內(nèi)鈣庫調(diào)節(jié)指標(biāo))mRNA和蛋白表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO所致TRPC1和PLC-γ1mRNA和蛋白表達(dá)抑制;無鈣培養(yǎng)時(shí)可致細(xì)胞遷移抑制,D149可改善無鈣培養(yǎng)所致的細(xì)胞遷移抑制,但不能使細(xì)胞遷移恢復(fù)正常水平,提示其可影響胞外Ca

9、2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+,從而提高細(xì)胞[Ca2+]cyt,又以促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流作用更明顯。(3)對(duì)Rho GTPase的影響:能提高細(xì)胞遷移過程Rho GTPase(RhoA、Rac1和Cdc42)mRNA和蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)DFMO所致的RhoA、Rac1和Cdc42mRNA和蛋白表達(dá)抑制。
  結(jié)論:
  四君子湯多糖經(jīng)提取純化后,糖含量和純度升高,促進(jìn)細(xì)胞遷移藥效活性也隨之增強(qiáng);分離純化后的四君子湯多糖組分D14

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