白術(shù)多糖通過(guò)多胺和Ca2+調(diào)節(jié)IEC-6細(xì)胞遷移及粘附連接蛋白的研究.pdf

1、研究背景：
　　胃腸黏膜損傷是脾虛證的臨床表現(xiàn)之一，益氣健脾是脾虛證的主要治法，胃腸黏膜保護(hù)是益氣健脾中藥的重要作用之一，含白術(shù)的益氣健脾方劑如四君子湯、補(bǔ)中益氣湯、參苓白術(shù)散等對(duì)胃腸黏膜損傷有修復(fù)作用。胃腸黏膜損傷修復(fù)過(guò)程包括上皮細(xì)胞遷移、增殖、分化、黏附連接和黏膜重建等環(huán)節(jié)，多胺對(duì)此過(guò)程是必需的且是焦點(diǎn)指標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣健脾中藥黃芪、白術(shù)、黨參、甘草及四君子湯的提取物（多糖、黃酮提取物等）能促進(jìn)小腸上皮（IEC-

2、6）細(xì)胞遷移，提高多胺及其信號(hào)通路指標(biāo)水平，并對(duì)相關(guān)抑制劑的抑制有逆轉(zhuǎn)作用，尤其提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平（[Ca2+]cyt）是關(guān)鍵指標(biāo)之一;益氣健脾中藥提取物（黃芪、白術(shù)、黨參、甘草的多糖提取物及四君子湯水提物等）有防治大鼠應(yīng)激性潰瘍的作用，作用機(jī)制與其影響胃或小腸黏膜多胺（精脒）含量有關(guān);還對(duì)提取分離純化得到的白術(shù)多糖樣品進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)表征。本研究在此基礎(chǔ)上，選擇已經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)表征的白術(shù)多糖樣品為受試藥，觀察其對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移、鈣離子水

3、平、細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響，為探討益氣健脾中藥白術(shù)胃腸黏膜損傷修復(fù)作用機(jī)制提供參考。
　　研究目的：
　　觀察白術(shù)多糖對(duì)小腸上皮IEC-6細(xì)胞遷移、鈣離子水平([Ca2+]cyt)和細(xì)胞黏附連接蛋白（E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白）表達(dá)的影響，為探討益氣健脾中藥白術(shù)胃腸黏膜損傷修復(fù)作用機(jī)制提供參考。
　　研究方法：
　　(1)劃痕法復(fù)制細(xì)胞遷移模型。
　　(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)[Ca2+]cyt

4、。
　　(3) HE染色法觀察IEC-6細(xì)胞形態(tài)。
　　(4)WesternBlot法檢測(cè)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-連環(huán)蛋白(α-catenin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)。
　　(5)免疫熒光法觀察E-cadherin、α-catenin、β-catenin蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果
　　(1)白術(shù)多糖對(duì)細(xì)胞遷移的影響
　?、俸}培養(yǎng)條件下，白術(shù)多糖（25或50或100m

5、g·L-1，下同）能促進(jìn)細(xì)胞遷移，逆轉(zhuǎn)DFMO（多胺合成抑制劑）所致細(xì)胞遷移的抑制，提示白術(shù)多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與其影響細(xì)胞多胺有關(guān)。
　?、跓o(wú)鈣培養(yǎng)條件下（以不含Ca2+的培養(yǎng)液代替常規(guī)含Ca2+培養(yǎng)液）可致細(xì)胞遷移抑制(與含鈣培養(yǎng)對(duì)照組比較P＜0.01)，白術(shù)多糖在無(wú)鈣培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響（與無(wú)鈣培養(yǎng)對(duì)照組比較P＞0.05），提示若去除胞Ca2+內(nèi)流途徑，則白術(shù)多糖對(duì)細(xì)胞遷移的作用明顯減弱。
　　(2)白術(shù)多糖對(duì)

6、細(xì)胞遷移過(guò)程[Ca2+]cyt的影響
　?、俸}培養(yǎng)條件下，白術(shù)多糖能提高細(xì)胞遷移過(guò)程[Ca2+]cyt，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低。
　　②無(wú)鈣培養(yǎng)條件下，[Ca2+]cyt明顯降低（與含鈣對(duì)照組比較P＜0.05）;白術(shù)多糖對(duì)無(wú)鈣培養(yǎng)所致的[Ca2+]cyt降低無(wú)明顯影響（與無(wú)鈣對(duì)照組比較P＞0.05）。提示若去除胞Ca2+內(nèi)流途徑，則白術(shù)多糖對(duì)[Ca2+]cyt的作用明顯減弱;結(jié)合白術(shù)多糖在無(wú)鈣培養(yǎng)條件下對(duì)

7、細(xì)胞遷移作用明顯減弱的結(jié)果，提示白術(shù)多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移和提高[Ca2+]cyt的作用可能與影響胞外Ca2+內(nèi)流有關(guān)。
　　(3)白術(shù)多糖對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
　　含鈣培養(yǎng)條件下，細(xì)胞與細(xì)胞之間邊緣突起較明顯，胞漿豐富，胞核較大，核仁增生活躍;無(wú)鈣培養(yǎng)條件下，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接比較平滑，胞漿豐富，細(xì)胞核較大，核仁增生活躍。提示含鈣培養(yǎng)與無(wú)鈣培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響較小，兩者之間雖細(xì)胞形態(tài)稍有改變，但無(wú)本質(zhì)區(qū)別。
　　白術(shù)多糖可稍微

8、改變無(wú)鈣培養(yǎng)所致的細(xì)胞之間較平滑的連接，可產(chǎn)生較短的細(xì)胞邊緣突起，但無(wú)法使細(xì)胞邊緣突起恢復(fù)至有鈣培養(yǎng)的形態(tài)。提示白術(shù)多糖對(duì)無(wú)鈣培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)的影響輕微。
　　(4)白術(shù)多糖對(duì)細(xì)胞粘附連接蛋白表達(dá)的影響
　　對(duì)E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響:白術(shù)多糖可提高E-鈣黏蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)DFMO所致E-鈣黏蛋白抑制，但不可逆轉(zhuǎn)無(wú)鈣培養(yǎng)所致的E-鈣黏蛋白表達(dá)抑制;提示白術(shù)多糖通過(guò)提高[Ca2+]cyt而增加E-鈣黏蛋白表達(dá)，其途徑可能主要通過(guò)

9、胞外Ca2+內(nèi)流。
　　對(duì)α-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響:白術(shù)多糖可提高α-連環(huán)蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)DFMO負(fù)荷和無(wú)鈣培養(yǎng)所致的α-連環(huán)蛋白表達(dá)抑制。
　　對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響:白術(shù)多糖可提高β-連環(huán)蛋白表達(dá);DFMO對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)有輕微抑制作用，白術(shù)多糖對(duì)DFMO所致的β-連環(huán)蛋白表達(dá)降低有改善作用;無(wú)鈣培養(yǎng)對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，白術(shù)多糖對(duì)β-連環(huán)蛋白表達(dá)也無(wú)明顯影響。
　　白術(shù)多糖對(duì)粘附連接蛋白表達(dá)影響的結(jié)果表明

10、:①正常含鈣培養(yǎng)時(shí)，白術(shù)多糖可提高細(xì)胞遷移過(guò)程E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白和β-連環(huán)蛋白表達(dá);②含鈣培養(yǎng)加DFMO負(fù)荷時(shí)，白術(shù)多糖可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)蛋白和β-連環(huán)蛋白表達(dá)降低，且對(duì)前兩種蛋白的作用更明顯;③無(wú)鈣培養(yǎng)時(shí)，白術(shù)多糖對(duì)E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但可使α-連環(huán)蛋白表達(dá)維持在含鈣培養(yǎng)的正常水平。綜上結(jié)果，提示白術(shù)多糖對(duì)粘附連接蛋白表達(dá)的影響與目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)及不同負(fù)荷條件產(chǎn)生的影響有關(guān)。