基于SGLT1通路探討四君子湯對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響.pdf

1、目的：
　　國內(nèi)經(jīng)多年研究，脾氣虛證患者存在腸道黏膜上皮細(xì)胞損傷及葡萄糖吸收的減少。益氣健脾法是中醫(yī)治療脾氣虛證的根本法則，益氣健脾方藥具有明顯的胃腸黏膜保護(hù)及改善脾氣虛證的葡萄糖吸收障礙的作用。本課題從體外培養(yǎng)細(xì)胞，研究觀察多胺對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖吸收和鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(SGLT1)通路的影響，并探討四君子湯“健脾助運(yùn)”的機(jī)理是否與多胺對(duì)SGLT1通路介導(dǎo)的葡萄糖吸收作用有關(guān)，為闡明脾主運(yùn)化、益氣健脾法及其方藥的作用

2、機(jī)制研究提供一個(gè)明確的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.Caco-2細(xì)胞模型的建立
　　MTT法檢測細(xì)胞增殖;Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)21天觀察其形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞微絨毛的結(jié)構(gòu);用電阻儀檢測細(xì)胞的跨膜電阻值(TEER)。
　　2.對(duì)Caco-2細(xì)胞黏膜的影響
　　大鼠分成兩組，空白對(duì)照組與四君子湯組，每天灌胃2次（四君子湯17 g·kg-1，空白對(duì)照組灌服等量生理鹽水），持續(xù)3d，最后一次給藥1h后腹主動(dòng)脈取血，制備四

3、君子湯含藥血清，檢測細(xì)胞增殖與微絨毛結(jié)構(gòu)變化。
　　3.對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　葡萄糖測定試劑盒及2-NBDG檢測Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取作用。
　　4.對(duì)Caco-2細(xì)胞SGLT1信號(hào)通路的影響
　　RT-PCR和Western blot檢測Caco-2細(xì)胞SGLT1及GLUT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化;流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子([

4、Ca2+] cyt)水平;Western blot檢測Caco-2細(xì)胞P-MLC蛋白的表達(dá)。
　　5.對(duì)Caco-2細(xì)胞多胺含量的影響
　　柱前衍生一高效液相色譜法(HPLC)檢測細(xì)胞內(nèi)多胺含量。
　　結(jié)果：
　　1.Caco-2細(xì)胞模型的建立
　　MTT法制備的生長曲線表明，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期處于在第2d～6d，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在15～16 d左右已基本形成緊密的細(xì)胞單層;對(duì)培養(yǎng)21 d的Caco-2

5、細(xì)胞做透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞已分化出微絨毛;用電阻儀測定不同時(shí)間的Caco-2細(xì)胞單層的TEER值，發(fā)現(xiàn)在15～16 d左右，電阻已＞500Ω·cm2，顯示細(xì)胞單層已經(jīng)形成。
　　2.對(duì)Caco-2細(xì)胞黏膜的影響
　　MTT結(jié)果顯示，DFMO對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用（P＜0.05），精脒(SPD)及四君子湯(SJZT)各劑量組均能改善DFMO的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01)，促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖;透

6、射電鏡觀察結(jié)果表明，DFMO組微絨毛明顯比對(duì)照組短（P＜0.05，＜0.01），且不規(guī)則，有破損;SPD及SJZT各劑量組均能改善DFMO對(duì)微絨毛生長的抑制作用(P＜0.05，P＜0.01)。
　　3.對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　用倒置熒光顯微鏡觀察，Caco-2細(xì)胞能有效攝取2-NBDG，SPD及SJZT能促進(jìn)正常Caco-2細(xì)胞攝取葡萄糖，且隨著SJZT濃度增強(qiáng)，其攝取葡萄糖的作用也越來越強(qiáng);同時(shí)能改善

7、DFMO及根皮苷作用下Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的抑制作用;葡萄糖檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示，SPD及SJZT能促進(jìn)正常Caco-2細(xì)胞的葡萄糖消耗（P＜0.05，P＜0.01)，同時(shí)能改善DFMO和根皮甘對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖消耗的抑制作用，促進(jìn)葡萄糖的吸收（P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.對(duì)Caco-2細(xì)胞SGLT1信號(hào)通路的影響
　　Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示，根皮苷及DFMO

8、的SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01);SPD和SJZT不僅可上調(diào)正常細(xì)胞SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01)，還可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO對(duì)SGLT1、GLUT2mRNA及蛋白表達(dá)的抑制，表明SPD和SJZT能明顯提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA及蛋白表達(dá)水平，且10％SJZT效果較明顯;FCM結(jié)果表明，根皮苷及DFMO組[Ca2+] cyt水平明顯低于對(duì)照組，S

9、PD及SJZT可提高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt水平（P＜0.05，P＜0.01)，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO的抑制作用(P＜0.05，＜0.01)，提高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt濃度;Western blot檢測P-MLC蛋白水平，結(jié)果顯示，根皮苷及DFMO作用細(xì)胞后，P-MLC蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01);加入SPD及四君子湯后，兩者不僅可提高P-MLC蛋白表達(dá)水平，還可逆轉(zhuǎn)根皮苷及DFMO對(duì)P-MLC蛋白表達(dá)

10、的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01)。
　　5.對(duì)Caco-2細(xì)胞多胺含量的影響
　　HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)多胺含量結(jié)果表明，DFMO作用Caco-2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)多胺（腐胺、精脒和精胺）含量明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)，SPD及SJZT不僅能提高正常Caco-2細(xì)胞內(nèi)多胺含量，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)由DFMO所致的細(xì)胞內(nèi)多胺含量的降低(P＜0.05，P＜0.01)，提高細(xì)胞中多胺的含量。
　　結(jié)論：
　　1.Ca

11、co-2細(xì)胞模型的建立
　　在本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞模型，符合體外研究小腸吸收實(shí)驗(yàn)的條件，且在培養(yǎng)至15～16 d時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.對(duì)Caco-2細(xì)胞黏膜的影響
　　結(jié)構(gòu)影響功能，改善或促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖及其結(jié)構(gòu)的改變，與細(xì)胞葡萄糖的吸收有關(guān)，四君子湯治療脾氣虛證的機(jī)理可能是通過改善小腸的吸收功能，修復(fù)受損的小腸組織細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)可能會(huì)影響葡萄糖相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，這有待于進(jìn)一步的研究。
　

12、　3.對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖攝取及消耗的影響
　　多胺及四君子湯能使DFMO及根皮苷作用后Caco-2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，促進(jìn)葡萄糖消耗的作用，可能與Caco-2細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)，多胺及四君子湯可能通過影響葡萄糖相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)葡萄糖的吸收。
　　4.對(duì)Caco-2細(xì)胞SGLT1信號(hào)通路的影響
　　多胺及四君子湯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖及葡萄糖吸收的作用與促進(jìn)SGLT1、GLUT2蛋白表達(dá)有關(guān)，這一過程與多胺

13、的合成有著密切聯(lián)系;二者可通過增加Caco-2細(xì)胞內(nèi)多胺含量，提高[Ca2+]cyt和P-MLC蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)SGLT1通路介導(dǎo)的葡萄糖吸收，從而促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖，改善腸黏膜的修復(fù)作用。
　　5.對(duì)Caco-2細(xì)胞多胺含量的影響
　　多胺及四君子湯均能促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的增殖與葡萄糖吸收作用，改善微絨毛結(jié)構(gòu)，同時(shí)多胺對(duì)SGLT1介導(dǎo)的葡萄糖吸收的過程起著調(diào)節(jié)作用，四君子湯還能提高細(xì)胞內(nèi)多胺的含量，由此證明四君子