Der f1的T細(xì)胞表位疫苗對哮喘小鼠的特異性免疫治療及對STAT4-STAT6信號通路的影響.pdf

1、目的:探討以粉塵螨Der f1的T細(xì)胞表位融合肽為疫苗對過敏性哮喘小鼠進(jìn)行特異性免疫治療的效果和對STAT4/STAT6信號通路的影響。
　　方法:將Der f1的8段T細(xì)胞表位，按照T1-T2-T3-T4-T5-T6-T7-T8連接方式合成融合肽，命名為Der f1T。將上述融合基因克隆到pET28a(+)中，構(gòu)建pET28a(+)-Der f1 T重組載體，用限制性內(nèi)切酶驗證，將pET28a(+)-Der f1 T重組載體轉(zhuǎn)入

2、E.coli BL21(DE3)中，用不同濃度的IPTG小劑量誘導(dǎo)表達(dá)Der f1 T，確定出最適濃度，然后在最適IPTG濃度條件下進(jìn)行Der f1T的大劑量表達(dá)并純化。制樣進(jìn)行SDS-PAGE、Western bloting鑒定分析表達(dá)的蛋白。以粉塵螨粗提液為致敏原，構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型，30只小鼠按每組10只隨機(jī)分為三組，PBS組、哮喘組和免疫治療組。以純化的Der f1 T細(xì)胞表位融合肽為疫苗對哮喘小鼠模型進(jìn)行特異性免疫治療。處

3、死小鼠，分別收集每組小鼠的標(biāo)本。應(yīng)用ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清和BALF中細(xì)胞因子IL-13和IFN-γ含量及血清中特異性IgE(sIgE)和IgG2a水平。提取各組肺組織蛋白行Western bloting鑒定STAT4/STAT6蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:雙酶切和測序結(jié)果說明原核表達(dá)載體pET28a(+)-Der f1T構(gòu)建成功;SDS-PAGE說明Der f1T誘導(dǎo)且純化成功;Western bloting進(jìn)一步說明D

4、er f1T蛋白純化成功;肺組織病理切片鏡檢說明，免疫治療組小鼠炎癥反應(yīng)比哮喘組炎癥明顯好轉(zhuǎn)，炎癥細(xì)胞浸潤減輕。小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)結(jié)果為免疫治療組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯低于哮喘組(p＜0.01)。免疫治療組小鼠的BALF中細(xì)胞因子IL-13含量與哮喘組小鼠相比顯著降低(p＜0.01)，IFN-γ含量的變化與之截然不同，免疫治療組明顯高于哮喘組(p＜0.01)。各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-13，免疫治療組明顯低于哮喘組(p＜0.01)