PML-RARα中NLS在急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床診斷中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分NLS在PML定位及其與importinα相互作用機(jī)制研究
　　目的：通過間接免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證PML、PML(NLS-)胞內(nèi)定位，以及通過間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證PML/PML(NLS-)與importinα之間的相互作用。
　　方法：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-PML、pCMV-HA-PML（NLS-）和pCMV-Myc-importinα并共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用間接免疫熒光檢測(cè)PML、PML

2、(NLS-)胞內(nèi)定位；利用免疫熒光雙標(biāo)法和免疫共沉淀分別驗(yàn)證PML/PML(NLS-)與importinα之間的相互作用；同時(shí)提取原代APL細(xì)胞、non-APL病人及正常人的中性粒細(xì)胞，運(yùn)用Western blot，免疫熒光，檢測(cè)中性粒細(xì)胞內(nèi)PML（NLS-）蛋白的表達(dá)與定位。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建真核質(zhì)粒pCMV-HA-PML、pCMV-HA-PML（NLS-）和pCMV-Myc-importinα；免疫熒光顯示PML定位與胞核中

3、呈斑點(diǎn)狀，PML(NLS-)主要定位于胞漿；免疫共沉淀顯示，使用兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML相互作用的蛋白，再用鼠抗Myc單克隆抗體進(jìn)行Western blott檢測(cè)，可以檢測(cè)mportinα蛋白;沉淀HA-PML(NLS-)相互作用的蛋白則不可以檢測(cè)到importinα蛋白；激光共聚焦顯微鏡下可觀察到PML與importinα共定位于胞核內(nèi),PML(NLS-)與importinα不存在共定位；原代APL細(xì)胞表達(dá)PML（NLS-

4、）蛋白并定位于細(xì)胞胞漿。而非APL病人和正常人的中性粒細(xì)胞胞漿中幾乎沒有PML（NLS-）表達(dá)，僅表達(dá)PML蛋白并定位于胞核。
　　結(jié)論：PML蛋白通過其NLS序列與importinα相互作用介導(dǎo)入核；PML（NLS-）可以作為APL診斷標(biāo)志。
　　第二部分抗PML蛋白核定位信號(hào)（NLS）抗體的制備及其在APL診斷中的應(yīng)用研究
　　目的：以NLS多肽作為免疫原，制備抗PML蛋白抗體。
　　方法：分析PML蛋白NL

5、S序列免疫原性，合成NLS多肽；以此多肽作為免疫原，免疫三只小鼠，兩周后加強(qiáng)免疫；末次免疫10天后取尾血制備抗體血清，以未免疫小鼠血清為對(duì)照，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)；WESTERN BLOT與間接免疫熒光驗(yàn)證抗體特異性。
　　結(jié)果：三支抗體血清ELISA檢測(cè)均有陽性反應(yīng)，其中2號(hào)抗體血清效價(jià)最高達(dá)1:50000，以2號(hào)抗體血清為一抗，western blot檢測(cè)野生型PML蛋白分子量大小約為70KDa;免疫熒光顯示PML位于胞核中