肝移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、背景：
　　對于各種原因引起的終末期肝病，目前肝移植仍是唯一確切有效的治療方法。但是肝源的缺乏、高昂的手術(shù)和術(shù)后治療費用以及各種術(shù)后并發(fā)癥限制了肝移植的廣泛開展。而肝臟干細(xì)胞移植為終末期肝病的治療提供了新的途徑，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mensenchymal stem cells，BMSCs)因其易分離擴(kuò)增、增殖分化潛能強、可自體取材等優(yōu)點，目前受到科研和臨床上的廣泛關(guān)注。但是移植BMSCs治療肝臟疾病仍存

2、在諸多爭議:(1)如何通過簡便易行的分離培養(yǎng)方法獲得活力好、純度高的BMSCs;(2)大多數(shù)終末期肝病均伴隨不同程度的門靜脈高壓，在門靜脈高壓這一特殊的血流動力學(xué)狀態(tài)下，移植的BMSCs能否順利遷移并定植于肝臟;(3)影響B(tài)MSCs向肝內(nèi)遷移定植的因子有哪些;(4)除分化為肝系細(xì)胞并替代其功能外，BMSCs會對肝細(xì)胞的存活和功能狀態(tài)產(chǎn)生何種影響。
　　目的：
　　1.探討體外分離、培養(yǎng)、純化BMSCs的可行性，觀察體外誘導(dǎo)的

3、BMSCs能否向肝系細(xì)胞分化。
　　2.比較經(jīng)脾移植的BMSCs在正常大鼠和門靜脈高壓大鼠肝內(nèi)的分布情況。
　　3.初步探討影響B(tài)MSCs向肝臟遷移定植的因素。
　　4.評估在體外不同共培養(yǎng)條件下BMSCs對肝細(xì)胞存活和功能的影響。
　　方法：
　　1.Sprague-Dawley(SD)大鼠全骨髓細(xì)胞差速貼壁培養(yǎng)法分離、純化、擴(kuò)增BMSCs，光鏡下觀察細(xì)胞生長及增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測第5代BMSCs表面

4、CD29、CD90及CD34的陽性率。肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF）和成纖維細(xì)胞生長因子-4（Fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4）聯(lián)合誘導(dǎo)第5代BMSCs向肝系細(xì)胞分化，光鏡及電鏡下觀察分化細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的變化，免疫熒光法檢測分化細(xì)胞甲胎蛋白(Alpha fetal protein，AFP)、細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin18，CK-18)和白蛋

5、白（Albumin，ALB）的表達(dá)情況。
　　2.受體大鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組。實驗組大鼠行膽總管結(jié)扎術(shù)，對照組大鼠實施假手術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)2周，經(jīng)脾移植CM-Dil熒光標(biāo)記的BMSCs分化細(xì)胞懸液，繼續(xù)飼養(yǎng)1周后，測定大鼠門靜脈壓力同時檢測肝功能。取肝組織制作石蠟切片，熒光顯微鏡下觀察肝組織內(nèi)移植細(xì)胞的分布情況并拍照，應(yīng)用圖像分析軟件計算各視野紅色熒光的積分光密度值（Integral optical density, IOD），并

6、分析其與門靜脈壓力關(guān)系。
　　3.取實驗組（膽總管結(jié)扎2周）和對照組大鼠肝臟組織，運用大鼠的全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)對實驗組大鼠和對照組大鼠肝臟的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較。芯片篩查出差異表達(dá)的基因，結(jié)合文獻(xiàn)報道和美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的Genebank中的基因功能，篩選可能與BMSCs遷移及粘附定植相關(guān)的基因。通過Real-time PCR和Western Blot技術(shù)在RNA和蛋白水平進(jìn)行驗證。初步篩選出可能與B

7、MSCs向肝臟遷移定植相關(guān)的因子。
　　4.灌注并消化人肝臟組織碎片，分離獲得游離肝細(xì)胞，分別將肝細(xì)胞體外獨立培養(yǎng)（Mono-culture，Mono組）、與常氧預(yù)處理的BMSCs間接共培養(yǎng)(Indirectco-culture with Normoxia preconditioned BMSCs，I-N組)、與缺氧預(yù)處理的BMSCs間接共培養(yǎng)（Indirect co-culture with Hypoxia preconditi

8、oned BMSCs，I-H組），與常氧預(yù)處理的BMSCs直接共培養(yǎng)（Direct co-culture with Normoxia preconditionedBMSCs，D-N組）、與缺氧預(yù)處理的BMSCs直接共培養(yǎng)（Direct co-culture withHypoxia preconditioned BMSCs，D-H組）。共培養(yǎng)第1、4、7天MTT法檢測肝細(xì)胞的存活情況，同時測定上清液中ALB的含量評估肝細(xì)胞功能。
　

9、　結(jié)果：
　　1.全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)24小時后可見BMSCs貼壁生長并逐漸分裂增殖。隨著連續(xù)傳代，BMSCs純度逐漸提高。細(xì)胞形態(tài)由原代細(xì)胞的不規(guī)則形或多邊形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫坏募忓N形。流式細(xì)胞儀檢測第5代BMSCs CD29和CD90陽性率均達(dá)96％以上。第5代BMSCs經(jīng)HGF、FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)2周后AFP、CK18和ALB表達(dá)均呈陽性。光學(xué)顯微鏡下顯示經(jīng)HGF、FGF-4誘導(dǎo)的第5代BMSCs逐漸趨于立方形，呈網(wǎng)格狀鑲嵌排列。電子

10、顯微鏡顯示未經(jīng)誘導(dǎo)的第1代和第5代BMSCs內(nèi)細(xì)胞器種類及數(shù)量無明顯差別，而經(jīng)過誘導(dǎo)的第5代BMSCs分化細(xì)胞內(nèi)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等細(xì)胞器均明顯增多。
　　2.CM-Dil標(biāo)記BMSCs的分化細(xì)胞后可使細(xì)胞膜呈現(xiàn)紅色熒光，標(biāo)記率高達(dá)95.5％。CM-Dil對細(xì)胞貼壁、生長及增殖無明顯影響。膽總管結(jié)扎的大鼠飼養(yǎng)2周后，逐漸出現(xiàn)梗阻性黃疸、白陶土樣便、深黃色尿。飼養(yǎng)3周后檢測肝功能顯示實驗組總膽紅素(Total bili

11、mbin，TB)、直接膽紅素(Direct bilirubin，DB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartateaminotransferase，AST）均較對照組明顯升高（TB:121.9±19.2 vs.8.7±4.2mmol/1;DB:116.9.9±19.4 vs.4.9±2.3mmol/1; ALT:105.9±72.7 vs.21.9±6.9u/1; AST:3

12、98.0±209.6 vs.22.1±9.0u/1，P＜0.01），血清ALB較對照組明顯降低（22.4±6.9 vs.32.2±3.7g/1，P＜0.05）。實驗組大鼠肝門部均形成0.5-1cm囊腫，肝臟明顯腫大變硬，表面布滿細(xì)小結(jié)節(jié)。實驗組大鼠門靜脈壓力明顯高于對照組（18.04±2.35 vs.9.75±1.40cmH2O，P＜0.01），提示形成了梗阻性黃疸伴門脈高壓的動物模型。肝臟病理紅色熒光IOD值實驗組明顯高于對照組(11

13、30067±209464 vs.293505±88383/Hpf, P＜0.01)。
　　3.經(jīng)全基因組表達(dá)譜芯片篩查，與細(xì)胞遷移相關(guān)的四個基因CX3CL1、CXCR4、MLLT4和PDGFA在實驗組肝臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)。Real-time PCR檢測兩組肝臟組織中CX3CL1、CXCR4、MLLT4和PDGFA在RNA水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組肝臟組織中CX3CL1(2-△△C=6.08)和CXCR4（2-△△C=2.00）

14、表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而MLLT4（2-△△C=1.15）和PDGFA（2-△△C=1.32）表達(dá)略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。Westernblot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，實驗組CX3CL1(0.64±0.08 vs.0.32±0.09)和CXCR4(0.63±0.15 vs.0.40±0.09)蛋白相對表達(dá)量明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　4.I-N組和D-N組肝細(xì)胞存活率

15、在共培養(yǎng)第4天和第7天均明顯高于Mono組(P＜0.05)。I-N組與D-N組比較、I-H組與D-H組比較，肝細(xì)胞存活率在共培養(yǎng)第1、4、7天均無差異(P＞0.05)。I-H組和D-H組肝細(xì)胞存活率在共培養(yǎng)第4天分別明顯高于I-N組和D-N組(P＜0.05)，而在第1天和第7天無差異（P＞0.05）。共培養(yǎng)第1、4、7天培養(yǎng)液中ALB含量，I-N組與Mono組比較均無差異(P＞0.05)，D-N組僅在共培養(yǎng)第4天高于Mono組(P＜0.

16、05)。D-N組ALB含量在共培養(yǎng)第4天高于I-N組（P＜0.05），而D-H組在共培養(yǎng)第4、7天高于I-H組(P＜0.05)。I-N組和I-H組、D-N組和D-H組比較在共培養(yǎng)第1、4、7天ALB含量均無差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.全骨髓細(xì)胞差速貼壁培養(yǎng)法可成功分離BMSCs，通過連續(xù)傳代可獲得純化。HGF和FGF-4可聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs分化為AFP、CK-18和ALB表達(dá)陽性的肝系細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs

17、分化細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生明顯改變。
　　2.CM-Dil是細(xì)胞移植較為理想的標(biāo)記示蹤材料。SD大鼠膽總管結(jié)扎2周后可出現(xiàn)明顯的黃疸癥狀，3周后形成典型的梗阻性黃疸伴門靜脈高壓的動物模型。膽汁性肝硬化致門靜脈壓力增高時，經(jīng)脾移植的BMSCs向肝內(nèi)遷移增多，提示可能存在某些化學(xué)性因子趨化移植的細(xì)胞進(jìn)入病變肝臟定植。
　　3.實驗組肝臟組織中CX3CL1和CXCR4在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)均高于對照組，提示CX3CL1