GS Rb1與IA對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞的作用及機(jī)理探究.pdf

1、目的:
　　1.通過培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞建立缺血缺氧模型，觀察心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境細(xì)胞損傷、凋亡與能量代謝變化情況。
　　2.觀察益氣活血中藥人參及毛冬青的主要有效成分人參皂苷Rb1(GS Rb1)及毛冬青甲素(IA)對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞損傷及凋亡的影響，探討GS Rb1與IA對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3.初步探索缺血缺氧心肌細(xì)胞中能量代謝AMPK-PGC-1α通路表達(dá)及腺苷酸生成情況，初步探討人參皂苷Rb1

2、(GS Rb1)與毛冬青甲素(IA)干預(yù)缺血缺氧心肌細(xì)胞的能量代謝途徑，了解其對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，為益氣活血法用于心力衰竭的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.原代心肌細(xì)胞缺血缺氧模型的建立:
　　選取新生SD乳鼠采集心肌組織消化成心肌細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，正常培養(yǎng)72h后利用缺血培養(yǎng)液及物理缺氧方法分別對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行缺血缺氧30min、1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h造模干預(yù)。通過氧氣含量指

3、示劑確認(rèn)缺氧水平，利用CCK8法檢測細(xì)胞活力，光鏡、電鏡觀察細(xì)胞損傷情況，建立缺血缺氧心肌細(xì)胞模型。
　　2.GS Rb1與IA對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞及線粒體的保護(hù)作用研究:
　　正常培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞48h后將細(xì)胞分為11組:正常組、模型組、曲美他嗪組、參高組、參低組、毛高組、毛低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組、參低毛低組。正常組與模型組繼續(xù)完全培養(yǎng)液正常放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，給藥組分別置換添加相應(yīng)濃度藥液的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2

4、4h，共培養(yǎng)72h。利用缺血缺氧造模方法對(duì)模型組及各給藥組進(jìn)行缺血缺氧造模干預(yù)6h，正常組繼續(xù)正常培養(yǎng)6h。78h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。利用CCK8檢測細(xì)胞活力、比色法檢測LDH、FFA、MDA水平、倒置顯微鏡、電鏡觀察細(xì)胞損傷情況、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率、流式細(xì)胞儀檢測mPTP開放情況。
　　3.GS Rb1與IA干預(yù)缺血缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的機(jī)制研究:
　　首先探討心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝相關(guān)代謝變化情況。將細(xì)胞

5、分為2組:正常組、模型組。利用前述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)造模及藥物干預(yù)，利用western blot檢測能量底物代謝相關(guān)蛋白AMPK、PGC-1a、PPARa、GLUT4、CPT-1、ACADM和線粒體生成相關(guān)蛋白Tfam、NRF2蛋白表達(dá)水平。探究人參皂苷Rb1與毛冬青甲素干預(yù)后缺血缺氧心肌細(xì)胞上述能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討兩藥干預(yù)缺血缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的相關(guān)機(jī)制。將細(xì)胞分為10組，分別為模型組、曲美他嗪組、參高組、參

6、低組、毛高組、毛低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組、參低毛低組。利用westernblot檢測上述能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)情況。高效液相色譜法檢測腺苷酸AMP、ADP、ATP含量。
　　結(jié)果:
　　1.原代心肌細(xì)胞缺血缺氧模型的建立:
　　通過氧氣含量指示劑確認(rèn)在缺氧盒內(nèi)心肌細(xì)胞達(dá)到缺氧要求。通過CCK8檢測細(xì)胞活性曲線和光鏡、電鏡觀察心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)形態(tài)學(xué)的改變，選取6h為缺氧造模時(shí)間點(diǎn)。模型組

7、與正常組心肌細(xì)胞比較具有明顯細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變，搏動(dòng)力顯著下降，細(xì)胞活力明顯降低，出現(xiàn)明顯的衰竭心肌細(xì)胞表現(xiàn)，缺血缺氧心肌細(xì)胞造模成立。
　　2.GS Rb1與IA對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞及線粒體的保護(hù)作用研究:
　　2.1.光鏡觀察:將心肌細(xì)胞進(jìn)行分組給藥后，倒置顯微鏡下可觀察到缺血缺氧模型組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞損傷表現(xiàn)，心肌搏動(dòng)力明顯下降，搏動(dòng)頻率減慢。曲美他嗪組較模型組心肌細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)未受明顯影響，細(xì)胞搏動(dòng)力

8、與頻率較正常組稍減，較模型組明顯好轉(zhuǎn)。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素給藥組細(xì)胞形態(tài)與搏動(dòng)力均較模型組有改善，以人參皂苷Rb1高劑量與毛冬青甲素高劑量聯(lián)用組心肌細(xì)胞保護(hù)作用最顯著，兩藥劑量與細(xì)胞保護(hù)效力呈量效關(guān)系。
　　2.2.電鏡觀察:通過電鏡下分析各分組給藥心肌細(xì)胞形態(tài)與各細(xì)胞器、線粒體形態(tài)，人參皂苷Rb1與毛冬青甲素干預(yù)組與曲美他嗪組細(xì)胞損傷程度較模型組均有不同程度改善，線粒體功能與完整性得到保護(hù)，并發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1與毛冬青甲素

9、高劑量聯(lián)用組抗缺血缺氧損傷效用與曲美他嗪作用相似，同時(shí)電鏡分析說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素在單藥與聯(lián)用對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用均存在量效關(guān)系，人參皂苷Rb1高劑量與毛冬青甲素高劑量單藥作用相似。
　　2.3.細(xì)胞活力檢測:通過CCK8法檢測細(xì)胞存活率顯示，模型組與正常組相比細(xì)胞存活率明顯減低。模型組與藥物干預(yù)組對(duì)比，各給藥干預(yù)組細(xì)胞存活率均有一定程度提高，兩藥聯(lián)用組較單藥組有更高效用，參高毛高組具有最明顯作用，顯著地改善了缺

10、血缺氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞損傷。
　　2.4.細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo):LDH、FFA、MDA檢測顯示:模型組與空白組對(duì)比LDH、FFA、MDA均明顯上升，缺血缺氧后細(xì)胞損傷模型建成。各給藥干預(yù)組與模型組對(duì)比，LDH、FFA、MDA含量均明顯降低。各給藥干預(yù)組對(duì)減低細(xì)胞內(nèi)LDH、FFA、MDA均有一定作用，作用分別呈量效關(guān)系。人參皂苷Rb1高低劑量均能夠明顯降低LDH含量，且呈量效關(guān)系。毛冬青甲素高劑量可降低LDH含量。兩藥聯(lián)用組能夠明顯降低L

11、DH，且作用較人參皂苷Rb1與毛冬青甲素單藥明顯，呈量效關(guān)系，參高毛高組具有最優(yōu)效用。參高毛高組在降低胞內(nèi)FFA有最優(yōu)效用（P＜0.01)。在給藥干預(yù)組與模型組的對(duì)比中，各個(gè)給藥組MDA含量與模型組有非常大的差異，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明各個(gè)給藥組都對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷有治療作用。在曲美他嗪組分別與參高組、參低組、參高毛高組、參低毛低組、參低毛高組的兩兩比較中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明這5組對(duì)MDA指示的細(xì)胞過氧化損傷與曲美他嗪治

12、療效應(yīng)相似。
　　2.5.MPTP開放檢測:利用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)對(duì)細(xì)胞質(zhì)、線粒體進(jìn)行染色，再通過氯化鈷與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣黃綠素發(fā)生反應(yīng)熒光猝滅，分析得線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔mPTP開放情況，從而得到在造模干預(yù)情況下細(xì)胞線粒體功能狀態(tài)。模型組熒光表達(dá)較正常組相比明顯下降，曲美他嗪組與參高毛高組比較相近，說明兩者在抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔開放方面具有相近效用。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素對(duì)抑制mPTP開放調(diào)控的作用均呈量效關(guān)系

13、。各藥物干預(yù)組與模型組對(duì)比均具有非常顯著的差異，說明各給藥組對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞線粒體膜損傷均有改善作用。
　　2.6.細(xì)胞凋亡:在TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率中，模型組凋亡率與正常組對(duì)比明顯上升，說明缺血缺氧造模后對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響巨大，能夠明顯地發(fā)揮促凋亡作用。與模型組相比，曲美他嗪組及參高組、參低組、毛高組、人高毛高組、人高毛低組、人低毛高組都均有明顯降低細(xì)胞凋亡率的作用，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素聯(lián)用及人身皂苷Rb1與毛

14、冬青甲素單用對(duì)抑制細(xì)胞凋亡均具有顯著作用。
　　3.GS Rb1與IA干預(yù)缺血缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的機(jī)制研究:
　　3.1.能量代謝通路蛋白表達(dá):觀察各分組心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)，模型組AMPK、PPARa、PGC-1a、CPT-1、ACADM、NRF2、Tfam與正常組對(duì)比均有不同程度下降，Glut4蛋白表達(dá)量在造模后無明顯變化。在給藥后，曲美他嗪組與參高毛高組AMPK表達(dá)量明顯高于其余各給藥組，且參

15、高毛高組蛋白表達(dá)量高于曲美他嗪組，P＜0.01，結(jié)果具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)各藥物對(duì)PPARa蛋白表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。與模型組對(duì)比，參高組、參低組與模型組對(duì)比能夠明顯提高缺血缺氧心肌細(xì)胞PGC-1a蛋白的表達(dá)量，兩兩對(duì)比P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參高毛高組、參高毛低組與模型組對(duì)比均有明顯差異，都能夠上調(diào)PGC-1a蛋白表達(dá)量，P＜0.01，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參高組、參低組和參高毛高組、參高毛低、參低毛高、參低毛低組兩兩比

16、較、存在量效關(guān)系，P＜0.01，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素聯(lián)用對(duì)PGC-1a表達(dá)量有明顯促進(jìn)作用，且與藥物濃度密切相關(guān)。曲美他嗪能夠明顯降低缺血缺氧心肌細(xì)胞CPT-1蛋白表達(dá)，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組兩兩相比，參高組、毛高組、參高毛高組、參低毛高組對(duì)CPT-1蛋白表達(dá)有負(fù)性作用，P＜0.01，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各給藥組與模型組對(duì)比蛋白表達(dá)趨勢均有下降，說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素?zé)o明顯促進(jìn)脂肪酸代謝作用。除參低

17、毛高組外，各給藥組對(duì)ACADM均無明顯促進(jìn)或抑制作用。曲美他嗪組GLUT4蛋白表達(dá)量上可見明顯升高，與模型組對(duì)比P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明曲美他嗪能夠顯著地上調(diào)GLUT4蛋白表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)利用葡萄糖進(jìn)入線粒體氧化功能。與模型組對(duì)比，參高組、參低組、毛高組、參高毛高組、參高毛低組與模型組兩兩比較均有明顯促進(jìn)作用，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明這幾組藥物配比與濃度可明顯增加GLUT4蛋白表達(dá)量。參高毛高組與其他藥物干預(yù)組兩兩

18、比較p值均＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參高毛高組在促進(jìn)GLUT4蛋白表達(dá)與葡萄糖代謝中具有最優(yōu)效用。在與模型組的兩兩比較中，各給藥干預(yù)組均能夠明顯地上調(diào)NRF-2蛋白表達(dá)量，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素對(duì)NRF-2蛋白有明顯激活效用，曲美他嗪組與參高組、參低組、毛高組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組兩兩比較結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該幾組具有相似的促進(jìn)NRF-2蛋白表達(dá)作用。參高毛高組與其余各給藥干預(yù)組的對(duì)比中P

19、＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明參高毛高組能夠顯著地促進(jìn)NRF-2蛋白表達(dá)，在各組中具有最優(yōu)效用。與模型組的比較中，各給藥干預(yù)組均能夠提高缺血缺氧心肌細(xì)胞Tfam蛋白的表達(dá)，P＜0.01，且與正常組比較均有明顯的調(diào)高現(xiàn)象，考慮與應(yīng)激性藥物刺激蛋白及線粒體的快速合成有關(guān)。在給藥干預(yù)組中，參高毛高組與其他各給藥組兩兩比較P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明人參皂苷Rb1與毛冬青甲素高劑量配伍給藥具有最優(yōu)效用。
　　3.2.高能磷酸化合物

20、生成:觀察各分組心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中能量代謝產(chǎn)物生成情況，模型組與正常組比較AMP含量明顯增加，ADP、ATP含量顯著下降，三者與正常組比較P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義在給藥組與模型組AMP含量的兩兩比較中，各給藥組都在一定程度上降低了缺血缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞AMP的含量，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在降低AMP含量方面，參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組能夠明顯降低AMP的效用。在給藥組與模型組ADP含量的比較中，發(fā)現(xiàn)各給藥干預(yù)組

21、ADP含量均有升高，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，曲美他嗪組與參高毛高組ADP含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，說明二者具有相似的升高ADP含量的作用。余組與ADP含量的提高大致呈量效關(guān)系。在給藥組與模型組ATP含量的比較中，曲美他嗪組、參高組、參低組、參高毛高組、參高毛低組、參低毛高組均有明顯提高ATP含量的作用，P＜0.01，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。毛高組、毛低組、參低毛低組在趨勢上對(duì)促進(jìn)ATP生成有一定表現(xiàn)，但與模型組比較P＞0.0

22、5，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.心肌細(xì)胞缺氧1h起即出現(xiàn)缺氧損傷表現(xiàn)，以缺血缺氧6h為造模條件制備心肌細(xì)胞缺血缺氧模型成立。
　　2.人參皂苷Rb1及毛冬青甲素對(duì)保護(hù)缺血缺氧心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)完整性、降低凋亡率、減少細(xì)胞脂質(zhì)沉積、減輕脂質(zhì)過氧化損傷、減少線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔的開放保護(hù)線粒體功能等都有明顯作用。單藥組中人參皂苷Rb1對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用總體優(yōu)于毛冬青甲素。
　　3.AMPK-PGC-1a通路可能是

23、調(diào)節(jié)缺血缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵通路。人參皂苷Rb1與毛冬青甲素都能夠明顯激活A(yù)MPK-PGC-1a通路，刺激葡萄糖代謝與線粒體生成。人參皂苷Rb1能夠降低AMP含量，促進(jìn)ADP、ATP生成，改善缺血缺氧心肌細(xì)胞能量代謝。毛冬青甲素能夠降低AMP含量，促進(jìn)ADP生成，對(duì)ATP生成無明顯作用。
　　4.人參皂苷Rb1與毛冬青甲素高劑量聯(lián)用在保護(hù)缺血缺氧心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)完整性、降低凋亡率、減少細(xì)胞脂質(zhì)沉積、減輕脂質(zhì)過氧化損傷、減少線粒