褐孢霉產(chǎn)生的人參皂甙Rb-,1-水解酶的分離純化及其性質(zhì).pdf

1、人參(Panax ginseng C.A.Mey)為五加科多年生草本植物人參的干燥根。人參在我國的藥用歷史已有約四千年，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》里，它就被列為上品?，F(xiàn)代藥學研究證明，人參對中樞神經(jīng)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)等都有顯著作用。人參皂甙是人參中的主要活性成分。人參中分離并鑒定的皂甙大約有40種。近年來的研究發(fā)現(xiàn)稀有人參皂甙Rd有很多重要的藥理活性，但由于在人參中的含量較低，直接從人參中分離這種稀有皂甙是非常困難的。而人參皂甙Rb1在人參中含量最

2、高，在結(jié)構(gòu)上和Rd只在C-20位上相差—個葡萄糖殘基，因此，通過對人參皂甙Rb1的結(jié)構(gòu)修飾來獲得稀有人參皂甙Rd具有非常重要的生理學意義。用酶轉(zhuǎn)化人參皂甙具有條件溫和，步驟簡單，定向轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物易分離，副產(chǎn)物少等眾多的優(yōu)點，是制備稀有人參皂甙的首選。 本實驗室經(jīng)過試驗研究從多種真菌中篩選出了一種真菌—褐孢霉，此菌能產(chǎn)生一種胞外β-糖苷酶，專一性水解Rb1為Rd。本文主要對褐孢霉產(chǎn)生的人參皂甙Rb1水解酶進行了分離純化及其性質(zhì)研究。

3、 本文的主要研究結(jié)果如下： 1.人參皂甙Rb1水解酶分離純化方法的探索 首先嘗試用多種方法對人參皂甙Rb1水解酶進行分離純化，以pNPG為底物檢測酶活。將培養(yǎng)7天的褐孢霉培養(yǎng)液依次通過超濾濃縮，(NH4)2SO4鹽析，DEAE-SepharoseCL-6B離子交換層析，Sepharose CL-6B層析，Q-Sepharose fast flow，Mono Q HR 5/5陰離子交換層析(HPLC)，最終得到一種

4、在電泳上基本呈單一條帶的β-糖苷酶。通過上述方法的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7天褐孢霉所產(chǎn)生的Rb1水解酶酶活較低，粗酶液在超濾濃縮過程中酶活有一定量的損失，在以后的實驗中應加以改進。 2.人參皂甙Rb1水解酶的分離純化 經(jīng)過了之前的條件探索，在大規(guī)模制備此酶的過程中進行了一些改良措施。經(jīng)過測定確定褐孢霉產(chǎn)生的Rb1水解酶的酶活力最高時應該是培養(yǎng)84h時，故取培養(yǎng)84h時的褐孢霉培養(yǎng)液依次經(jīng)過DEAE-纖維素離子交換層析，DEA

5、E-Sepharose CL-6B離子交換層析、(NH4)2SO4鹽析、Sepharose CL-6B凝膠層析、Phenyl sepharose CL-4B疏水層析、Mono Q HR5/5陰離子交換層析(HPLC)和Bio-Scale CHT20-1(HA)羥基磷灰石層析，最后得到在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶且在凝膠過濾層析中呈單一對稱峰的β-糖苷酶，并應用SDS-PAGE電泳和凝膠過濾層析對其純度和分子量進行了測定，純度可達9

6、8％以上，利用SDS-PAGE電泳測得此酶的分子量為105KD，用凝膠過濾層析測定其分子量為210KD，說明此酶是由兩個亞基組成的二聚體蛋白。經(jīng)過純化得到的純酶與之前的粗酶液相比，純化倍數(shù)達到540倍，酶活回收率為7％，純化后的比活力可達到23768U/mg。 3.人參皂甙Rb1糖苷酶的酶學性質(zhì)的研究： 對純化后的β-糖苷酶進行的酶學性質(zhì)研究表明：酶的最適溫度為45℃，溫度低于40℃時酶的穩(wěn)定性較好。最適pH為5.5，

7、在pH 5-6.5范圍內(nèi)酶的穩(wěn)定性較好。Ca2+，Mg2+，Ba2+在0.25M時分別對酶活性顯現(xiàn)一定的抑制作用，酶的相對酶活力分別下降到80％，79％和78％，Na+，K+，Mn2+在0-0.25M的濃度范圍內(nèi)對酶活性幾乎沒有影響，EDTA，Cu2+，Zn2+在0.25M對酶活性有較強的抑制作用，而SDS在0.25M對酶活性有強烈的抑制作用。在加入巰基保護劑后，SDS對酶活的影響降低，提示酶分子中的二硫鍵應該處在酶發(fā)揮活性的關鍵部位。

8、酶的底物專一性測定表明此酶對β-葡萄糖苷鍵具有特異性。酶對底物的水解能力依次是纖維二糖、乳糖、蔗糖、pNPG和人參皂甙Rb1。動力學參數(shù)的研究表明酶的Km值為0.18 mM，最大反應初速度為5.52 mM/min。氨基酸序列分析結(jié)果證明此酶為一種新的蛋白，并與屬于糖苷水解酶家族3的真菌β-糖苷酶有顯著的同源性。 綜上所述，本論文從褐孢霉培養(yǎng)液中分離純化出了一種能夠高效水解人參皂甙Rb1的β-糖苷酶，并對其酶學性質(zhì)進行了鑒定。用此