新月彎孢霉漆酶的產(chǎn)生、分離純化及對(duì)染料脫色的研究.pdf

1、本研究從染彎孢菌葉斑病的玉米葉片中分離出一株真菌，經(jīng)丁香醛連氮法、愈創(chuàng)木酚法和ABTS法聯(lián)合檢測(cè)顯示該菌株是一株高產(chǎn)漆酶的菌株。經(jīng)菌落形態(tài)，孢子形態(tài)等形態(tài)特征并結(jié)合ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)域的序列鑒定確認(rèn)該菌為新月彎孢霉，菌株編號(hào)為jqh-100。新月彎孢霉是半知菌類、多孢亞科、彎孢屬的一種真菌，是引起玉米、水稻等禾本科植物病害的重要病原菌之一，也是生產(chǎn)氫化可的松前體物的重要菌種之一，但是關(guān)于其產(chǎn)漆酶的研究國(guó)內(nèi)外刊物未見

2、報(bào)道。本文在參考其它真菌漆酶研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了新月彎孢霉產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件，新月彎孢霉胞外漆酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)，以及新月彎孢霉在染料脫色中的應(yīng)用。
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)及Plackett-burman實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到新月彎孢霉產(chǎn)漆酶的最適工藝條件為:培養(yǎng)基初始pH6.0，培養(yǎng)溫度35℃，種齡60h，搖床轉(zhuǎn)速150 rpm/min，250 mL三角瓶中裝入150 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成份為:黃豆芽200

3、g/L煮汁，蔗糖20 g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨3 g/L，硝酸銨1.2 g/L，外加0.05mmol/L CuSO4、MnSO4和MgSO4，吐溫800.2 mL/L，并加0.1 mmol/L愈創(chuàng)木酚作為誘導(dǎo)劑;優(yōu)化后最大酶活力可達(dá)2.8 U/mL，約是優(yōu)化前的5倍。酶活高峰出現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)的第72h。
　　通過(guò)硫酸銨鹽析，DEAE-Sepharose FF離子交換層析和SephadexG-75凝膠過(guò)濾等一系列純化技術(shù)，對(duì)新月

4、彎孢霉胞外漆酶進(jìn)行了純化，最終純化倍數(shù)為2.14，總活力回收率為22.76％，由SDS-PAGE電泳圖計(jì)算得出純酶的分子量為83.8 kDa。
　　以ABTS作為底物時(shí)新月彎孢霉純化后的漆酶的最適反應(yīng)pH為2.8，米氏常數(shù)為0.069 mmol/L，在pH2.6～3.8維持較高的酶活，超過(guò)pH4.0漆酶活性急劇下降;純酶最適反應(yīng)溫度為30℃。純酶在30℃時(shí)在pH4.0～6.4的緩沖液中保溫1h較穩(wěn)定;在最適pH2.8下純酶在40℃

5、以下較穩(wěn)定，超過(guò)40℃酶活迅速下降，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，純酶在1h內(nèi)完全失去活性。以丁香醛連氮為底物時(shí)，純酶的最適反應(yīng)pH為5.0，米氏常數(shù)為0.149 mmol/L。通過(guò)12種金屬離子對(duì)漆酶活力的影響研究顯示: Fe2+、Fe3+對(duì)酶活有強(qiáng)烈的抑制作用， Cu2+在5 mmol/L對(duì)酶活有明顯的促進(jìn)作用。
　　染料菌體共培養(yǎng)體系和純酶對(duì)染料都有較好的脫色效果，共培養(yǎng)體系通過(guò)菌體吸附及漆酶降解作用對(duì)茜素紅的脫色率達(dá)到了90％;純