一種番茄褐孢霉產(chǎn)生的高選擇性轉(zhuǎn)化人參皂甙Rb-,1-為Rd的β-葡萄糖苷酶.pdf

1、人參（Panax ginseng C．A Maye）為五加科人參屬植物，是我國的傳統(tǒng)名貴中藥。人參皂甙是人參的有效成分，到目前為止，已經(jīng)從人參中發(fā)現(xiàn)40多種人參皂甙。各種人參皂甙的含量不同，結(jié)構(gòu)多樣，藥理活性也有很大的差別。研究發(fā)現(xiàn)某些在人參中含量很低的稀有人參皂甙具有很高的藥用價值和應(yīng)用前景。但是，稀有人參皂甙含量太低，很難從人參中直接提取，依靠目前的化學(xué)合成技術(shù)也難以工業(yè)生產(chǎn)。制備這些稀有人參皂甙唯一可行的方法是改變某些高含量人參皂

2、甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)來完成?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法通常選擇性較差，產(chǎn)率較低，同時容易造成環(huán)境污染。生物轉(zhuǎn)化則具備條件溫和、選擇性較好、副產(chǎn)物少、得率高、無污染和容易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，被認為是制備稀有人參皂甙最具有潛力的方法。本論文通過篩選發(fā)現(xiàn)，番茄褐孢霉產(chǎn)生的高選擇性糖苷水解酶能將人參中含量最高的人參皂甙Rb1水解為唯一產(chǎn)物——稀有人參皂甙Rd。本文探索了這種β—葡萄糖苷酶的分離純化條件，研究了它的分子特征和性質(zhì)，為工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本論文的主

3、要結(jié)果如下： 1、從40種植物病原真菌中篩選出七種能夠不同程度地轉(zhuǎn)化人參皂甙的真菌，各種真菌的轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物不同。其中番茄褐孢霉能夠特異性轉(zhuǎn)化人參皂甙Rb1成為Rd。最佳轉(zhuǎn)化條件為：加底物時間，24 h；底物濃度，0．25 mg/ml；培養(yǎng)液pH值，pH5-6；培養(yǎng)時間，8d；培養(yǎng)溫度，37℃。番茄褐孢霉產(chǎn)生轉(zhuǎn)化人參皂甙Rb1成為Rd的糖苷酶的最佳產(chǎn)酶條件為：V8汁培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)84小時。 2、培養(yǎng)84h的番茄褐孢霉V

4、8汁培養(yǎng)液經(jīng)過過濾離心、DEAE—cellulose陰離子交換柱層析、硫酸銨沉淀、Sepharose CL-6B凝膠過濾柱層析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱層析以及Mono Q陰離子交換柱層析等多步分離技術(shù)結(jié)合，成功分離純化出一種電泳純的β—葡萄糖苷酶G—I（人參皂甙Rb1轉(zhuǎn)化酶G—I）。G—I的純化工藝具有很高的穩(wěn)定性，能夠保證其穩(wěn)定制備。每50升番茄褐孢霉培養(yǎng)液約可獲得0．5 mg活性蛋白，回收率為9％，比活力

5、達17563 U/mg。 3、Superose610/300 GL凝膠過濾柱層析分析（HPLC）顯示G—I的洗脫曲線為對稱峰，分子量為80 KDa；經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）和等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF—PAGE）檢測，圖譜均顯示為一條蛋白帶，分子量為80 KDa，等電點（pI）為4．2，表明G—I已達至電泳純，且為一種單鏈蛋白質(zhì)，相對分子量為80 KDa。經(jīng)胰蛋白酶水解、電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜

6、（Q—TOF2）分析，獲取了G—I中3個多肽鏈的氨基酸序列：1．LVAHEENVR，2．VGKDEGFAKAGGLSR，3．LPLEAGESGTATFNVR。利用BLAST工具在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）統(tǒng)一蛋白知識庫中進行查詢和比對，沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸完全相同的多肽段，表明此酶為一種新蛋白。將此肽段的氨基酸序列上傳到統(tǒng)一蛋白知識數(shù)據(jù)庫（UniProtKnowledgebase），得到了其授予的序列接受號P85

7、516。G—I的氨基酸序列與β—葡萄糖苷酶家族3的幾種真菌β—葡萄糖苷酶有高度的同源性，可能屬于此家族的成員之一。 4、酶反應(yīng)動力學(xué)實驗證實，G—I具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在pH4.0～11.0范圍內(nèi)和40℃以下表現(xiàn)出良好的β—葡萄糖苷酶活性，最適反應(yīng)pH值為pH6.0，最適反應(yīng)溫度為45℃。Cu2+，2n2+在50mM時對酶活性有較強的抑制作用，相反，Na+、K+、Ca2+、Mrr2+和Mg2+對酶活性有輕微的刺激作用

8、。0.25 M的SDS沒有影響G—I的酶活性，0.25 mM的EDTA只是輕微抑制了G—I的活性。G—I的Km值為0.18 mM，最大反應(yīng)初速度Vmax為5.52 mM/min。底物專一性分析發(fā)現(xiàn)，G—I能高特異性水解人工合成的底物pNPG，還能水解β—葡萄糖苷鍵連接的二糖如纖維二糖、龍膽二糖和槐二糖，再次表明此酶為一種β—葡萄糖苷酶。G—I對人參皂甙的底物專一性研究表明，此酶對人參皂甙Rb1表現(xiàn)了很強的水解活性，可達到pNPG的22.