瑞士乳桿菌蛋白酶的分離純化及其水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽研究.pdf

1、近年來研究發(fā)現(xiàn)采用某些瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的發(fā)酵乳有較強(qiáng)的降高血壓功能，主要是由于在發(fā)酵過程中，瑞士乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)分解乳蛋白產(chǎn)生多肽，這些多肽則對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)具有抑制作用，從而達(dá)到了降低血壓的效果。本文就瑞士乳桿菌主要蛋白酶的分離純化及其理化特性，以及它們在發(fā)酵乳制品中水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的作用進(jìn)行

2、了研究，并分離純化了一種乳清蛋白源性的ACE抑制肽。
　　 通過對(duì)瑞士乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶(CEP)，氨肽酶N(PepN)，X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶(PepX)和肽鏈內(nèi)切酶活性的研究，發(fā)現(xiàn)CEP，PepN，PepX的活性較高，于是確定CEP，PepN，PepX為研究對(duì)象。采用響應(yīng)面分析法對(duì)瑞士乳桿菌發(fā)酵乳產(chǎn)ACE抑制肽的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了如下最適條件：接種量4％，發(fā)酵液初始pH值7.5，培養(yǎng)溫度39℃，在此發(fā)酵條件下

3、所得酸乳的ACE抑制活性為75.46±0.42％。用相關(guān)系數(shù)評(píng)定ACE抑制肽的活性與CEP，PepN和PepX的關(guān)系，初步推測瑞士乳桿菌CEP是水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的關(guān)鍵蛋白酶。
　　 采用超聲波破碎瑞士乳桿菌細(xì)胞壁提取CEP，PepN和PepX。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)瑞士乳桿菌細(xì)胞壁破碎的條件包括菌液濃度、破碎功率和破碎時(shí)間進(jìn)行了研究，以PepN的活性為響應(yīng)值，得到了破碎細(xì)胞壁的最佳條件：菌體濃度為0.0238g

4、/mL的瑞士乳桿菌細(xì)胞懸液，破碎功率為300W，破碎總時(shí)間為26min(工作時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s)。通過硫酸銨沉淀，SephacrylS-300HR層析，非變性-PAGE切膠回收蛋白純化了瑞士乳桿菌的CEP，PepN和PepX。CEP，PepN和PepX的比酶活力分別為20.53mg/mL，43.41mg/mL，62.24mg/mL。用純化的CEP，PepN，PepX體外水解乳蛋白以確定這三種酶與ACE抑制肽產(chǎn)生的關(guān)系，更進(jìn)一步證實(shí)了

5、CEP是水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的關(guān)鍵蛋白酶。
　　 純化的瑞士乳桿菌CEP為單體結(jié)構(gòu)，分子量為～40kDa。CEP的最適酶反應(yīng)溫度為33℃，最適酶反應(yīng)pH為6.0。Co2+，Mg2+，Ca2+能夠激活CEP的活性，Zn2+，Ni2+和EDTA能夠抑制CEP的活性，表明CEP為一種金屬酶。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)CEP有抑制作用，表明CEP為一種絲氨酸蛋白酶。CEP的Km為0.115mM，N端氨基酸序列為Gln-Ile-I

6、le-Thr-Asp-Ile-Tyr-Ala-Arg-Glu。瑞士乳桿菌PepN分子量大約為24kDa，最適酶反應(yīng)pH為7.0，最適酶反應(yīng)溫度為37℃。Co2+對(duì)PepN活性有激活作用，Zn2+，Ni2+，F(xiàn)e3+對(duì)PepN活性有強(qiáng)烈的抑制作用，EDTA對(duì)PepN活力也有一定的抑制作用，表明PepN為金屬蛋白酶。瑞士乳桿菌的PepX分子量大約為26kDa，最適酶反應(yīng)pH為7.0，最適酶反應(yīng)溫度為37℃。Co2+對(duì)PepX有激活作用，Zn

7、+，Ni2+，Mn2+，F(xiàn)e3+對(duì)PepX有強(qiáng)烈的抑制作用，EDTA對(duì)PepX也有一定的抑制作用，表明PepX為金屬蛋白酶。同時(shí)，絲氨酸蛋白酶PMSF對(duì)PepX也有抑制作用，表明PepX為一種絲氨酸肽酶。
　　 采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定了瑞士乳桿菌蛋白粗酶水解乳清蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的最優(yōu)條件。通過控制三個(gè)主要的水解條件([E]/[S]，水解pH，水解溫度)改變水解產(chǎn)物的ACE抑制活性。實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)的水解條件，即[E]/[S](w/

8、w)為0.006，水解pH為8.60，水解溫度為38.90℃，在此條件下酶解乳清蛋白，最后水解產(chǎn)物的ACE抑制率為92.21士0.45％，IC50為0.975mg/mL，水解度為18.76％。采用SephadexG-75，SephadexG-15，RP-HPLC分離純化了一種乳清蛋白源性的ACE抑制肽，該ACE抑制肽IC50為0.13mg/mL。同時(shí)采用了ESI-MS/MS對(duì)純化的ACE抑制肽測定了氨基酸序列，氨基酸序列為Arg-Leu