青蒿TFAR1基因啟動(dòng)子組織定位與轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、青蒿素(Artemisinin)是從青蒿(Artemisia annua L.)中提取的新型倍半萜內(nèi)酯化合物，是治療抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧的首選藥物。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ATCs)治療瘧疾。在天然的青蒿中，青蒿素的含量?jī)H占干重的0.01％～0.6％，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)要求。近年來(lái)，隨著對(duì)青蒿素生物合成途徑的深入研究以及關(guān)鍵酶基因的克隆，利用遺傳工程技術(shù)改造青蒿素生物合成途徑被認(rèn)為是提高青蒿素含量的有效手段

2、之一。
　　青蒿腺毛體特異的脂肪酰輔酶A還原酶(TFAR1)是脂肪酰輔酶A家族(FAR)成員，其功能可能是合成青蒿花和葉發(fā)育過(guò)程中的腺毛體的表皮蠟質(zhì)和特異性控制青蒿腺毛體的生長(zhǎng)和發(fā)育，最終影響青蒿素的合成。
　　本研究根據(jù)NCBI所報(bào)道的TFAR1基因序列（登錄號(hào):GU733320），利用PCR技術(shù)，從青蒿中克隆TFAR1基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示:TFAR1屬于FAR(fatty acyl-CoA red

3、uctase)超家族成員。熒光定量PCR檢測(cè)MeJA和ABA處理青蒿植株后，TFAR1基因的表達(dá)量情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):MeJA和ABA促進(jìn)FAR1的表達(dá)。構(gòu)建含有TFAR基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301+-TFAR1，利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化青蒿葉片，獲得再生抗性青蒿植株。設(shè)計(jì)跨35S啟動(dòng)子檢測(cè)引物，進(jìn)行抗性青蒿植株的基因組PCR檢測(cè)。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)最終確定有7株獨(dú)立轉(zhuǎn)化的青蒿苗為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，并將這7株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株分別命名為T(mén)1、T2、

4、T3、T4、T5、T6、T7。以EF1α作為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株TFAR1基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照cont1、cont2、 cont3相比，轉(zhuǎn)基因株系TFAR1基因的表達(dá)量均有不同程度的提高，其中T3、T4、T5、T6、T7五個(gè)株系的表達(dá)量提高了幾十倍，達(dá)到了極顯著水平。利用高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)青蒿素、二青青蒿酸、青蒿酸含量，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因株系青蒿素含量與對(duì)照相比，均有不同程度的提高，其中T2

5、、T4、T5、T6、T7青蒿素含量與對(duì)照cont1、cont2、cont3相比，呈現(xiàn)極顯著提高，T5含量最高是對(duì)照的1.25-1.3倍;轉(zhuǎn)基因株系二青青蒿酸的含量與對(duì)照相比均有不同程度的提高，其中T1、T3、T5、T6呈現(xiàn)極顯著提高，T7呈現(xiàn)顯著性提高，含量最高的T6株系二青青蒿酸含量的對(duì)照的2.55-3.3倍;轉(zhuǎn)基因株系青蒿酸的含量與對(duì)照相比僅T2未表現(xiàn)出顯著性差異，其他6株均呈現(xiàn)極顯著提高，其中T6株系的含量最高是對(duì)照的3.5-7.

6、5倍。綜上所述，在青蒿中超量表達(dá)TFAR1基因能夠促進(jìn)青蒿素及其代謝產(chǎn)物的合成，提高青蒿素及其代謝產(chǎn)物的含量。
　　除了在轉(zhuǎn)基因水平驗(yàn)證TFAR1基因的功能，本研究還根據(jù)青蒿基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（未公布）設(shè)計(jì)TFAR基因啟動(dòng)子特異性引物，利用PCR技術(shù)，克隆得到TFAR1基因啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示:本研究所克隆的FAR1啟動(dòng)子全長(zhǎng)2243bp，包含MeJA的響應(yīng)元件、與MYC結(jié)合的G-box、與WRKY結(jié)合的W-b

7、ox、與MYB結(jié)合的MBS等順式作用元件。構(gòu)建含有TFAR1啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證載體pCAMBIA1305-TFAR1，以擬南芥為材料，采用蘸花法將獲得的GV3101-pCAMBIA1305-TFAR1工程菌轉(zhuǎn)化擬南芥;待擬南芥種子成熟，收獲種子后，進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，進(jìn)行擬南芥各個(gè)組織部位的GUS染色。結(jié)果顯示:TFAR1啟動(dòng)子在擬南芥的幼苗、莖、葉、花均被染成藍(lán)色;在嫩葉上表現(xiàn)為僅有腺毛體被染成藍(lán)色，并且腺毛體基部染色較深;從