青蒿TFAR1基因啟動子組織定位與轉基因研究.pdf

1、青蒿素(Artemisinin)是從青蒿(Artemisia annua L.)中提取的新型倍半萜內酯化合物，是治療抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧的首選藥物。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用以青蒿素為基礎的聯(lián)合療法(ATCs)治療瘧疾。在天然的青蒿中，青蒿素的含量僅占干重的0.01％～0.6％，遠不能滿足市場要求。近年來，隨著對青蒿素生物合成途徑的深入研究以及關鍵酶基因的克隆，利用遺傳工程技術改造青蒿素生物合成途徑被認為是提高青蒿素含量的有效手段

2、之一。
　　青蒿腺毛體特異的脂肪酰輔酶A還原酶(TFAR1)是脂肪酰輔酶A家族(FAR)成員，其功能可能是合成青蒿花和葉發(fā)育過程中的腺毛體的表皮蠟質和特異性控制青蒿腺毛體的生長和發(fā)育，最終影響青蒿素的合成。
　　本研究根據NCBI所報道的TFAR1基因序列（登錄號:GU733320），利用PCR技術，從青蒿中克隆TFAR1基因序列，并對其進行生物信息學分析，結果顯示:TFAR1屬于FAR(fatty acyl-CoA red

3、uctase)超家族成員。熒光定量PCR檢測MeJA和ABA處理青蒿植株后，TFAR1基因的表達量情況，結果發(fā)現(xiàn):MeJA和ABA促進FAR1的表達。構建含有TFAR基因的植物表達載體pCAMBIA2301+-TFAR1，利用葉盤法轉化青蒿葉片，獲得再生抗性青蒿植株。設計跨35S啟動子檢測引物，進行抗性青蒿植株的基因組PCR檢測。經過PCR檢測最終確定有7株獨立轉化的青蒿苗為轉基因陽性植株，并將這7株轉基因陽性植株分別命名為T1、T2、

4、T3、T4、T5、T6、T7。以EF1α作為內參基因，利用熒光定量PCR檢測轉基因植株TFAR1基因的相對表達量，結果顯示，與對照cont1、cont2、 cont3相比，轉基因株系TFAR1基因的表達量均有不同程度的提高，其中T3、T4、T5、T6、T7五個株系的表達量提高了幾十倍，達到了極顯著水平。利用高效液相色譜儀(HPLC)檢測青蒿素、二青青蒿酸、青蒿酸含量，結果顯示:轉基因株系青蒿素含量與對照相比，均有不同程度的提高，其中T2

5、、T4、T5、T6、T7青蒿素含量與對照cont1、cont2、cont3相比，呈現(xiàn)極顯著提高，T5含量最高是對照的1.25-1.3倍;轉基因株系二青青蒿酸的含量與對照相比均有不同程度的提高，其中T1、T3、T5、T6呈現(xiàn)極顯著提高，T7呈現(xiàn)顯著性提高，含量最高的T6株系二青青蒿酸含量的對照的2.55-3.3倍;轉基因株系青蒿酸的含量與對照相比僅T2未表現(xiàn)出顯著性差異，其他6株均呈現(xiàn)極顯著提高，其中T6株系的含量最高是對照的3.5-7.

6、5倍。綜上所述，在青蒿中超量表達TFAR1基因能夠促進青蒿素及其代謝產物的合成，提高青蒿素及其代謝產物的含量。
　　除了在轉基因水平驗證TFAR1基因的功能，本研究還根據青蒿基因組數據庫（未公布）設計TFAR基因啟動子特異性引物，利用PCR技術，克隆得到TFAR1基因啟動子序列，并對其進行生物信息學分析，結果顯示:本研究所克隆的FAR1啟動子全長2243bp，包含MeJA的響應元件、與MYC結合的G-box、與WRKY結合的W-b

7、ox、與MYB結合的MBS等順式作用元件。構建含有TFAR1啟動子的功能驗證載體pCAMBIA1305-TFAR1，以擬南芥為材料，采用蘸花法將獲得的GV3101-pCAMBIA1305-TFAR1工程菌轉化擬南芥;待擬南芥種子成熟，收獲種子后，進行篩選，獲得轉基因陽性植株，進行擬南芥各個組織部位的GUS染色。結果顯示:TFAR1啟動子在擬南芥的幼苗、莖、葉、花均被染成藍色;在嫩葉上表現(xiàn)為僅有腺毛體被染成藍色，并且腺毛體基部染色較深;從