BACE1基因啟動(dòng)子核心區(qū)域的研究.pdf

1、目的:確定BACE1基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，尋找對(duì)于BACE1基因的轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用的順式作用元件和最小啟動(dòng)子區(qū)域，揭示BACE1基因核心啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)并研究相應(yīng)的功能。
　　方法:在前期研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體。用常規(guī)方法培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞HEK293，用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將構(gòu)建的含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體

2、轉(zhuǎn)染HEK293并使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)熒光素酶。用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)試劑測(cè)定細(xì)胞裂解液熒光素酶的活性并用內(nèi)參照載體的活性進(jìn)行校準(zhǔn)，最終活性比值反映BACE1基因啟動(dòng)子的活性，然后比較其活性在不同載體之間的差異，確定具有啟動(dòng)子活性的最小區(qū)域的5'端邊界和3'端邊界。在此基礎(chǔ)上，以p3BU-1149/-400或p3BU-583/-400為模板，通過(guò)基因定點(diǎn)突變確定BACE1候選順式作用元件的核心序列，通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的反向突變質(zhì)粒來(lái)

3、驗(yàn)證順式作用元件的功能，并研究各順式作用元件間的相互作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建一系列含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體，最長(zhǎng)的插入片段為874bp，包含BACE1的翻譯起始位點(diǎn)上游1273到400的序列，即B1U-1273/-400，繼續(xù)刪切并轉(zhuǎn)染，5'刪切分析發(fā)現(xiàn)-583/-574和-560/-540這兩個(gè)區(qū)域有可能含有啟動(dòng)子功能發(fā)揮所需的元件。3'刪切分析發(fā)現(xiàn)-480可能是BACE1啟動(dòng)子活性所必需的。-

4、510/-480對(duì)于BACE1的啟動(dòng)子活性起著關(guān)鍵作用。-550/-480可能是BACE1基因的啟動(dòng)子核心區(qū)域。通過(guò)基因定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)578G/A，510A/C附近各存在一個(gè)功能性的順式作用元件區(qū)域而且各順式作用元件在影響B(tài)ACE1啟動(dòng)子活性方面具有協(xié)同作用，將這兩個(gè)順式作用元件序列分別命名為T(mén)CE1，TCE2，TCE1是一個(gè)高度保守的近端激活因子，TCE1與核心啟動(dòng)子之間間隔的堿基個(gè)數(shù)而不是堿基的種類(lèi)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有重要作用，TCE2與B

5、ACE1的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。通過(guò)查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)及5'RACE的結(jié)果發(fā)現(xiàn)BACE1的核心啟動(dòng)子區(qū)域不含有任何已知的經(jīng)典核心啟動(dòng)子元件。
　　結(jié)論:通過(guò)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功找到了BACE1基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，而且確定了兩個(gè)控制BACE1轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵元件TCE1，TCE2，這兩個(gè)元件可以相互作用，其中TCE1是一個(gè)高度保守的近端激活因子，TCE2與BACE1的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。最終發(fā)現(xiàn)BACE1的核心啟動(dòng)子區(qū)域不含有任何已知的經(jīng)典核心啟動(dòng)子元件，這