石墨烯對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的影響及機(jī)理研究.pdf

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是現(xiàn)代分子生物學(xué)核心技術(shù)之一,它能夠在體外擴(kuò)增DNA,并能使微量的模板在數(shù)小時內(nèi)以指數(shù)形式擴(kuò)增數(shù)百萬倍。但在實際運(yùn)用中,PCR技術(shù)還存在一定的限制,如復(fù)雜背景下的非特異性產(chǎn)物、擴(kuò)增效率等問題。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米技術(shù)和生物技術(shù)的融合引起了人們的關(guān)注,為解決生物技術(shù)難題提供了契機(jī)。石墨烯具有高比表面積、良好的熱傳導(dǎo)性和生物相容性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。本論文研究了石墨烯對PCR反應(yīng)的影響,并探討其

2、影響機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.石墨烯的制備:以天然石墨為原料,采用改進(jìn)的Hummers法制備了氧化石墨烯;以水合肼為還原劑,在氨水中制備了水溶性良好的還原石墨烯。所得石墨烯片尺寸大小為200nm～2μm;還原石墨烯表面羧基含量約為5.29％,羥基含量約為2.55％,氨基含量約為7.2％;
　　 2.石墨烯增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性的研究:以pET032a質(zhì)粒DNA和基因組DNA為模板進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增,基于還原石墨烯

3、的PCR反應(yīng)能進(jìn)行8輪和3輪,還原石墨烯的最優(yōu)濃度分別為12μg/mL和10μg/mL;基于氧化石墨烯的PCR擴(kuò)增僅能進(jìn)行2輪,且第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性較低。還原石墨烯還能拓寬PCR的退火溫度范圍,使PCR反應(yīng)低至25℃時依然能夠退火,得到單一的目的產(chǎn)物;對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定,結(jié)果顯示石墨烯參與的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的序列與標(biāo)準(zhǔn)序列沒有差異;
　　 3.石墨烯增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性機(jī)制的研究:測定石墨烯與PCR各組分的Zeta電

4、位,還原石墨烯-pfuDNA聚合酶的Zeta電位為5.39 mV,因此帶正電的還原石墨烯-PfuDNA聚合酶復(fù)合物利于吸附帶負(fù)電的引物和模板到石墨烯表面,從而減少非特異性產(chǎn)物,提高PCR反應(yīng)的特異性;向被還原石墨烯抑制的PCR體系中加入牛血清白蛋白(BSA),當(dāng)其濃度高于5μg/mL時,可解除高濃度還原石墨烯的抑制,表明PfuDNA聚合酶吸附在石墨烯表面;UV-Vis、圓二色光譜表明石墨烯與PfuDNA聚合酶發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。因此石墨