干擾小分子蛋白Sulfiredoxin-1對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷影響的初步研究.pdf

1、背景：
　　腦卒中等腦缺血性腦血管疾病發(fā)病率、致殘率與死亡率一直居高不下，給社會(huì)及家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。腦缺血再灌注損傷使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成機(jī)體活性氧的釋放，使機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)清除能力的平衡失調(diào)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷在腦缺血疾病中起著至關(guān)重要的作用。小分子蛋白Sulfiredoxin-1(Srxn1),屬于內(nèi)源性保守的Sulfiredoxin抗氧化家族的成員，具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與抗氧化、抗凋亡以及抗炎癥等作用有

2、關(guān)。
　　本課題擬采用慢病毒載體干擾Srxn1基因表達(dá)，在體外以O(shè)GD誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷來模擬腦缺血再灌注，初步探討干擾Sulfiredoxin-1對(duì)OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　目的：
　　初步探討干擾Sulfiredoxin-1對(duì)OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法：
　?。?）篩選氧糖剝奪（OGD）最佳時(shí)間，用不同時(shí)間的OGD（0h，2h，4h，6h

3、，8h），復(fù)氧24h，作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，運(yùn)用MTS和LDH檢測篩選出最佳OGD作用時(shí)間。
　?。?）構(gòu)建三條小發(fā)夾Srxn1干擾慢病毒載體（shRNA-Srxn1–LV3298，shRNA-Srxn1–LV3385，shRNA-Srxn1–LV3456）及一條陰性載體（LV3NC），運(yùn)用慢病毒感染技術(shù)將各個(gè)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，運(yùn)用Westernblot和QPCR檢測干擾效率，篩選出最佳

4、干擾載體。
　　（3）運(yùn)用篩選出的最佳OGD時(shí)間作用于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以模擬氧化應(yīng)激損傷模型。運(yùn)用MTS和LDH測定細(xì)胞的活性和損傷程度。
　?。?）建立完整的Srxn1干擾的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型，并運(yùn)用Westernblot檢測Srxn1的蛋白水平，QPCR檢測Srxn1的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　?。?）MTS和LDH顯示，OGD6h/復(fù)氧24h為最佳的氧化應(yīng)激模型。
　?。?）倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯

5、示，慢病毒瞬時(shí)感染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞效果顯著，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到85％以上。
　　（3）Westernblot和QPCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比較，shRNA-Srxn1–LV3298及shRNA-Srxn1–LV3385的干擾效率不明顯，shRNA-Srxn1–LV3456的干擾效率顯著（p<0.01）。
　　（4）MTS和LDH檢測結(jié)果顯示，干擾Srxn1后能導(dǎo)致細(xì)胞活性明顯下降，細(xì)胞損傷顯著加重（p<0.05，p<0