高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞VEGFR表達(dá)的影響.pdf

1、目的:糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。DM合并血管病變是DM的主要并發(fā)癥之一,也是患者致死、致殘的主要因?yàn)?。目前的研究認(rèn)為DM大血管病變后側(cè)枝形成能力受損是引起DM患者血管病變最重要原因的之一。關(guān)于DM合并血管病變的發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn),既往提出四種機(jī)制,即多元醇通路的激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advancedglycation end product

2、s,AGEs)的形成、PKC途徑及氨基已糖途徑的激活,這些均不能夠完全解釋DM血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。最近的研究表明,氧化應(yīng)激參與了心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,Banting獎(jiǎng)獲得者Brownlee M提出“糖尿病并發(fā)癥的共同機(jī)制”學(xué)說(shuō),指出線粒體電子傳遞鏈過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)量是高血糖導(dǎo)致血管損傷的共同機(jī)制。該學(xué)說(shuō)合理解釋了氧化應(yīng)激與糖尿病血管損傷的內(nèi)在聯(lián)系,被認(rèn)為是糖尿病并發(fā)癥研究領(lǐng)域的一個(gè)突破性進(jìn)展,獲得了廣泛關(guān)注。氧化應(yīng)激增強(qiáng)所致的血管病

3、變與DM患者血管病變臨床后果及其病理改變相似,都涉及到內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖能力和新生血管的形成能力受損。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管新生最重要的因子之一,有人研究認(rèn)為VEGF分泌減少導(dǎo)致了血管新生功能障礙,但在DM大鼠后肢缺血模型中發(fā)現(xiàn)VEGF的分泌并未減少,研究還發(fā)現(xiàn)VEGF治療DM合并的缺血性疾

4、病效果更差。提示DM患者肢體缺血后血管快速血運(yùn)重建受阻與VEGF無(wú)關(guān)。目前,高糖對(duì)EPCs自身氧化應(yīng)激水平的影響以及這種影響對(duì)EPCs表面血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor ReceptorVEGFR)表達(dá)產(chǎn)生的影響國(guó)內(nèi)外還尚無(wú)相關(guān)研究。我們利用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離大鼠骨髓沖洗液中的單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)3天后用Dil-標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-labeled acetyl

5、ated LDL,DiI-acLDL)和FITC標(biāo)記荊豆凝集素-1(fluorescein isothiocyanate-labeled Ulex europaeusagglutinin-1,FITC-UEA-1)雙染法進(jìn)行的鑒定,顯示雙熒光陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)。完成鑒定后的大鼠EPCs給予不同濃度(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度分別15mmol／L、30 mmol／L

6、、60 mmol／L)的高糖干預(yù),分別在24h、48h、96h進(jìn)行EPCs增殖能力檢測(cè)和自身氧化應(yīng)激標(biāo)志物的檢測(cè),評(píng)估高糖對(duì)EPCs增殖和自身氧化應(yīng)激水平的影響。最后,觀察高糖對(duì)大鼠EPCs表面VEGFR表達(dá)的影響,并通過(guò)抗氧化劑干預(yù)治療研究,初步探討高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)EPCs表面VEGFR表達(dá)的影響,為糖尿病患者肢體缺血后快速血運(yùn)重建受阻提供理論支持。
　　 方法:將12只SD大鼠脫頸處死,用75％酒精浸泡消毒15 min。

7、置于超凈臺(tái)中,在無(wú)菌條件下分離其股骨和脛骨,剪去長(zhǎng)骨兩端,暴露骨髓腔,用5ml注射器抽取含有1％肝素的PBS液沖洗骨髓腔,直至骨髓腔發(fā)白。利用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離大鼠骨髓沖洗液中的單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)3天后用DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染法進(jìn)行的鑒定,顯示雙熒光陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor eells,EPCs)。5天后進(jìn)行細(xì)胞傳代和試驗(yàn)分組,根據(jù)培養(yǎng)液中終末葡萄糖濃度的不同分成

8、兩組:正常對(duì)照組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為5.5 mmol／L)和高糖干預(yù)組。高糖干預(yù)組又分為三個(gè)亞組:高糖1組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為15 mmol／L葡萄糖)；高糖2組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為30 mmol／L)；高糖3組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為60 mmol／L)。分別在24h、48h、96h用MTT法進(jìn)行EPCs增殖檢測(cè)和檢測(cè)試劑盒進(jìn)行氧化應(yīng)激標(biāo)志物抗O2-、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glut

9、athione,GSH)檢測(cè),最后在有和無(wú)抗氧化劑的治療干預(yù)下用免疫組化進(jìn)行EPCsVEGFR表達(dá)檢測(cè)。
　　 結(jié)果:1.光鏡下大鼠EPCs的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),剛分離的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形,體型較小,在培養(yǎng)2天后出現(xiàn)貼壁,3d后有明顯集落形成,可見(jiàn)梭形細(xì)胞和細(xì)胞簇出現(xiàn),其結(jié)構(gòu)與血島相似,梭形細(xì)胞既有單個(gè)細(xì)胞也有線帶樣結(jié)構(gòu)。7d后梭形細(xì)胞線樣排列,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,細(xì)胞形態(tài)逐漸變大,呈現(xiàn)出典型鋪路石樣改變。2.培養(yǎng)3d后的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的Di

10、I-acLDL和FITC-UEA-1雙陽(yáng)性染色,證實(shí)為EPCs。3.EPCs增殖能力檢測(cè)。高糖作用24h后與正常對(duì)照組(5.5 mmol／L)比較,高糖3組(60 mmol／L)的EPCs增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05),高糖1組(15mmol／L)和高糖2組(30 mmol／L)無(wú)明顯差異；高糖作用48h后,高糖2組和高糖3組EPCs增殖能力顯著減弱(P<0.05)；作用96h后,高糖2組和高糖3組EPCs增殖能力進(jìn)一步減弱(P<0.

11、05),正常對(duì)照組與高糖1組無(wú)明顯差異。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與24h比較,正常對(duì)照組和高糖1組在48h和96h EPCs增殖能力分別顯著增強(qiáng)(P<0.05)；高糖2組EPCs增殖能力無(wú)明顯差異:高糖3組EPCs增殖能力在96h顯著減弱(P<0.05)。4.EPCs抗O2-濃度檢測(cè)。高糖作用24h后與正常對(duì)照組比較,高糖1組的EPCs抗O2-濃度明顯增加(P<0.05)；作用48h后與正常對(duì)照組比較,高糖干預(yù)組EPCs抗O2-濃度明顯減少(

12、P<0.05)；作用96h后與正常對(duì)照組比較高糖干預(yù)組EPCs抗O2-濃度進(jìn)一步減少(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與24h相比,正常對(duì)照組在48h后抗O2-濃度明顯增加(P<0.05)；高糖1組無(wú)明顯差異；高糖2組和高糖3組在48h和96h抗O2-濃度均明顯減少(P<0.05)。5.EPCs MDA濃度檢測(cè)。高糖作用24h后與正常對(duì)照組比較,高糖干預(yù)組EPCs MDA濃度均無(wú)明顯差異；作用48h后,高糖2組和高糖3組EPCs MD

13、A濃度顯著增加(P<0.05)；作用96h后,高糖干預(yù)組EPCs MDA濃度均顯著增加(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與24h比較,正常對(duì)照組在48h和96hEPCs MDA濃度均無(wú)明顯變化；高糖1組在96h后EPCs MDA濃度顯著增加(P<0.05)；高糖2組和高糖3組在48h和96h后EPCs MDA濃度均顯著增加(P<0.05)。6.EPCs的GSH含量檢測(cè)。高糖作用24h后與正常對(duì)照組比較,高糖干預(yù)組EPCs的GSH含量無(wú)

14、明顯變化；作用48h和96h后高糖2組和高糖3組EPCs的GSH含量均顯著降低(P<0.05)；高糖1組無(wú)明顯變化。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與24h相比,正常對(duì)照組在48h和96h后EPCs的GSH含量均顯著增加(P<0.05)；高糖1組EPCs的GSH含量無(wú)明顯差異；高糖2組和高糖3組在48h和96h后EPCs的GSH含量均顯著減弱(P<0.05)。7.EPCs VEGFR表達(dá)檢測(cè)。(1).高糖分別作用24h和48h后與正常對(duì)照組比較,高糖

15、2組和高糖3組EPCsVEGFR表達(dá)均顯著減少(P<0.05)；作用96h后,與正常對(duì)照組比較高糖干預(yù)組EPCs VEGFR表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與24h相比,正常對(duì)照組無(wú)明顯變化；高糖1組和高糖3組在96h后EPCs VEGFR表達(dá)明顯減少(P<0.05)；高糖2組EPCs VEGFR表達(dá)在48h和96h后均明顯減少(P<0.05)。(2).在有抗氧化劑存在條件下,各實(shí)驗(yàn)組EPCs VEGFR表達(dá)隨時(shí)間,濃

16、度變化沒(méi)有明顯的差異。(3).與無(wú)抗氧化劑比較,抗氧化劑提高了高糖干預(yù)組EPCs VEGFR表達(dá),在一定的程度上挽救了高糖干預(yù)組EPCs VEGFR表達(dá)的嚴(yán)重缺陷。
　　 結(jié)論:1.高糖明顯的抑制了大鼠EPCs增殖,且隨著葡萄糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用愈來(lái)愈強(qiáng)。2.高糖誘導(dǎo)大鼠EPCs自身氧化應(yīng)激增強(qiáng),抗氧化應(yīng)激明顯減弱。且隨葡萄糖濃度的增加,時(shí)間的延長(zhǎng)作用愈來(lái)愈強(qiáng)。3.高糖明顯抑制大鼠EPCs VEGFR的表達(dá),但在