ECFP-SUMO-EYFP融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及其鑒定.pdf

1、目的： 通過(guò)Gateway技術(shù)結(jié)合酶切連接的方法，將ECFP基因、CYFP基因與人SUMO基因連接起來(lái)形成ECFP-SUMO-EYFP融合基因，并將此基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)，為進(jìn)一步的熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.通過(guò)PCR技術(shù)將ECFP基因擴(kuò)增出來(lái)，并通過(guò)兩步法PCR反應(yīng)和BP反應(yīng)將ECFP基因片段克隆到到質(zhì)粒pDeliver02，構(gòu)建入門克隆ECFP Dev02，并經(jīng)過(guò)提取質(zhì)粒、

2、經(jīng)酶切鑒定，并測(cè)序確定。 2.通過(guò)PCR技術(shù)將EYFP基因擴(kuò)增出來(lái)，并通過(guò)兩步法PCR反應(yīng)和BP反應(yīng)將EYFP基因片段克隆到到質(zhì)粒pDeliver01，構(gòu)建入門克隆EYFP Dev01，并經(jīng)過(guò)提取質(zhì)粒、經(jīng)酶切鑒定，并測(cè)序確定。再通過(guò)酶切、連接和RJ反應(yīng)，將EYFP基因克隆到表達(dá)載體pReceiver-B01.1中，構(gòu)建表達(dá)載體EYFP B01.1。 3.構(gòu)建融合基因：PCR擴(kuò)增SUMO1，SUMO2，SUMO3基因，

3、通過(guò)酶切、連接，與EYFP B01.1構(gòu)建融合的SUMO1-EYFP B01.1，SUMO2-EYFP B01.1，SUMO3-EYFP B01.1表達(dá)載體；PCR擴(kuò)增ECFP基因，純化該基因，通過(guò)酶切、連接，分別與SUMO1-EYFP B01.1，SUMO2-EYFP B01.1，SUMO3-EYFPB01.1構(gòu)建ECFP-SUMO1-EYFP B01.1， ECFP-SUMO2-EYFP B01.1，ECFP-SUMO3-EYFP

4、B01.1融合基因表達(dá)載體。 4.融合基因ECFP-SUMO1-EYFP，ECFP-SUMO2-EYFP，ECFP-SUMO3-EYFP分別在大腸桿菌BL21中表達(dá)并純化，通過(guò)用SDS-PAGE鑒定融合基因，并通過(guò)Ni-NTA離子交換柱層析純化，最終得到純化后的融合蛋白，并以酶切實(shí)驗(yàn)初步分析了SENP相對(duì)于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特異性。 結(jié)果： 1.成功的構(gòu)建入門克隆ECFP Dev02和E

5、YFP Dev01，成功構(gòu)建表達(dá)載體EYFPB01.1。 2.成功的構(gòu)建融合基因ECFP-SUMOs-EYFP，并同時(shí)構(gòu)建SUMOs三種亞型的融合基因。 3.ECFP-SUMO-EYFP蛋白在大腸桿菌BL21獲得可溶性表達(dá)，SDS-PAGE分析表明表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量(Mr)與預(yù)期相符，ULP、SENPs對(duì)底物ECFP-SUMOs-EYFP的酶切特異性檢測(cè)表明ECFP-SUMOs-EYFP可被有效酶切用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移