小鼠Myostatin基因表達載體的構建及體外表達鑒定.pdf

1、目的：
　　 隨著現(xiàn)代生活習慣的改變和生活質量的提高，很多人開始胖起來，肥胖癥已漸漸成為危害全球人類健康的重要疾病，與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、脂代謝異常、胰島素抵抗、非酒精性肝病、哮喘以及關節(jié)炎等等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。脂肪細胞中脂質的過度積聚是肥胖癥形成其中的中心環(huán)節(jié)，多種因素參與過程其中，但是發(fā)病機制還不完全清楚，因此關于此方面的研究，對肥胖癥的防治有重要意義并逐漸成為熱門的課題。1997年美國基因學家發(fā)現(xiàn)肌

2、肉生長抑素(Myostatin)及其基因(MSTN)，對肌肉生長具有抑制作用，目前研究者普遍認為肌肉是全身最大的耗能組織之一，肌肉生長抑素的缺乏可導致肌肉異常增生，同時可能出現(xiàn)肌肉耗能增加，從而調控能量的分配，對認識肥胖的發(fā)病機制可能有重大的意義。本研究擬用質粒構建技術及基因表達技術，構建該基因的表達載體，期待用于觀察MSTN基因過表達對肥胖小鼠體重、內臟脂肪含量、糖脂代謝等的影響，進而進一步通過該工具觀察探討MSTN與肥胖癥的關系。<

3、br>　　 方法：
　　 1、小鼠MSTN蛋白表達質粒pcDNA3.1(+)-mMSTN的構建：
　　 1.1、mMSTNcDNA插入片段的擴增：從ICR小鼠肌肉組織中提取總RNA，經RT-PCR，獲得大量拷貝的MSTNcDNA，然后插入pEASY-T1克隆載體中，經BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后，獲得帶有酶切位點的小鼠MSTN表達序列片段。
　　 1.2、載體片段的獲得：以pcDNA3.1(+)質粒轉化TOP1

4、0感受態(tài)細菌，得到該質粒的大量拷貝后，大量提取，經BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖電泳回收，獲得用于構建mMSTN表達質粒的載體片段。
　　 1.3、應用T4DNA連接酶，將帶有酶切位點的mMSTN擴增片段，與pcDNA3.1(+)質粒酶切以后的載體片段進行連接，構建成pcDNA3.1(+)-mMSTN質粒。
　　 2、pcDNA3.1(-)-mZAG表達質粒的體外鑒定：應用陽離子脂質體轉染方法將pcDNA3.1

5、(+)-mMSTN質粒瞬時轉染到小鼠3T3-L1前脂肪細胞中,48h后收集細胞提起RNA，逆轉錄合成cDNA后，用real-timePCR方法觀察細胞中MSTN的表達情況。
　　 結果：
　　 1．成功克隆小鼠MSTNcDNA全序列，并將其與pcDNA3.1(+)載體片段連接，構建成pcDNA3.1(+)-mMSTN表達質粒。
　　 2．在體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細胞系中，證實MSTN表達質粒pcDNA3