融合基因cryIAC-cmgI構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文融合基因cryIAC-cmgI構(gòu)建及原核表達(dá)姓名：尹莉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：昆蟲生態(tài)學(xué)指導(dǎo)教師：張國(guó)安20090601華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士學(xué)位論文A b s t r a c tB a c i l l u st h u r i n g i e r r s i s ( B O i so n e o f t h em o s t w i d e l y e x p l o i t e d i n s e

2、 c t i c i d a lm i c r o b e s ．B t g e n e sc o d i n gi n s e c t i c i d a lp r o t e i n sh a v eb e e nt r a n s f e r r e di n t oa v a r i e t yo fi m p o r t a n tg r a i na n dc o t t o nc r o p s ．B tc r o p s

3、 a r e s i g n i f i c a n t l y r e s i s t a n tt om a j o r i n s e c tp e s t s ，b u tt h e ya r e s t i l ls u s c e p t i b l et op a t h o g e n i cd i s e a s e s ．p - 1 ，3 一g l u c a n a s e i s a ni m p o r t a

4、 n tr e s i s t a n tc o m p o u n di n p l a n t s ．I t c a r l i n h i b i t t h eg r o w t ha n d r e p r o d u c t i o no f p l a n t f u n g a lp a t h o g e n s ，m a k i n g i t a n e f f e c t i v ea g e n t t oc

5、o n t r o lf u n g a lp a t h o g e n si nd e v e l o p i n g t r a n s g e n i cd i s e a s er e s i s t a n t p l a n t ．T h e r e f o r e ，i tw o u l d b ei n t e r e s t i n gt oc r e a t e t r a n s g e n i cc r o p

6、 s t r a i n s t h a th a r b o rb o t h i n s e c tr e s i s t a n tg e n ea n dd i s e a s er e s i s t a n tg e n e ．I n o r d e rt o c o n s t r u c tt h e r e c o m b i n a n ts t r a i nw i t h t o x i c i t ya n d

7、r e s i s t a n c e t o b o t h i n s e c t p e s t sa n df u n g a lp a t h o g e n s ，w e c o n s t r u c taf u s i o n g e n e o fB a c i l l u st h u r i n g i e r r s i s ( c r y l A c ) a n dp - 1 ，3 - g l u c a n

8、a s e ( c m 9 1 ) ．W ei n t e n dt od e v e l o pt h et r a n g e n i c r i c ew i t h t h i sf u s i o n g e n e ．T h e m a i n r e s u l t s a sf o l l o w s ：1 ．S p e c i f i cp r i m e r sw i t ht h ee n z y m e s r

9、e s t r i c t i o ns i t e sw e r ed e s i g n e dt ot h ec r y l A cg e n es e q u e n c e ．U s i n g t h i s p a i ro f p r i m e r s ，t h ec r y l A cg e n eW a sa m p l i f i e df r o mt h e p l a s m i dp C R 2 ．1 一

10、c r y l A c ．T h e P C Rf r a g m e n t o fc r y l A c a n dt h e p l a s m i dp E T - 2 2 b ( + ) w e r eb o t hd i g e s t e db yN d e I ／H i n d l I I ．T h e nt h e yw e r el i n k e db yT 4D N A l i g a s ea n dt r a

11、 n s f o r m e di n t o E ．c o l it oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp E T - 2 2 b —A c ．2 ．S p e c i f i cp r i m e r sw i t ht h ee n z y m e sr e s t r i c t i o ns i t e sw e r ed e s i g n e

12、 dt o t h e c m g lg e n es e q u e n c e ．U s i n g t h i sp a i ro f p r i m e r s ，t h ec m g lg e n e W a sa m p l i f i e d f r o m t h ep l a s m i d p G E M - T - C M G ．T h e P C R f r a g m e n to f c m g la n d

13、 t h e p l a s m i d p E T - 2 2 b ( + )w e r eb o t hd i g e s t e db yH i n d l I F X h o I ．T h e nt h e yw e r el i n k e db yT 4D N A l i g a s ea n d t r a n s f o r m e d i n t oE ．c o l i t oc o n s t r u c t t h

14、 er e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T - 2 2 b - c m 9 1 ．3 ．T h ef r a g m e n to f c r y I A cd i g e s t e db yN d e I ／H i n d l I IW a sl i n k e dt ot h ep l a s m i do fp E T - 2 2 b —c m g lw h i c h w a s a

15、 l s od i g e s t e db yN d e I ／H i n d l l lw i m c m g lg e n e ．T h e yw e r e t r a n s f o r m e d i n t o E ．c o l i t o c o n s t r u c t t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dp E T - 2 2 b - A c - c m 9 1 ．4

16、．W es e p a r a t e l y t r a n s f o r m e dt h ep l a s m i d s o fp E T - 2 2 b —A c 、p E T - 2 2 b - c r n g la n dp E T - 2 2 b —A c —c m g li n t oR o s e t t a ( D E 3 ) ．T h e r e s u l t so f S D S —P A G Ec o n

17、 f i r m e d t h a tt h e s e t h r e eg e n e s c o u l d b e e x p r e s s e d ．5 ．W e p u r i f i e dt h ep r o t e i n so f c r y l A c - 6 H i s a n d c m g l - 6 H i s a td e n a t u r e ds t a t ew i t hN i z + a