融合多角體基因片段的原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及其表面機(jī)制初探.pdf

1、家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白具有高效表達(dá)且只在堿性條件(pH10.8及以上)下可溶的特殊性質(zhì)，因此，可將目的蛋白與其融合表達(dá)，一方面能提高目的蛋白的表達(dá)量，另一方面，通過簡單的pH梯度洗脫和差速離心的方法就可以獲得較純的融合蛋白，再經(jīng)過特異性蛋白酶酶切消化，回收得到較純的目的蛋白。但是，目前采用多角體融合外源蛋白表達(dá)時(shí)，由于多角體融合蛋白同樣需要在堿性條件下才可溶解，而在用蛋白酶進(jìn)行酶切融合蛋白而獲得單獨(dú)的目的蛋白的過程中，由于蛋白酶

2、反應(yīng)的最適合的pH值一般是中性(pH7-9)，就造成了酶切效率低，純目的蛋白回收率低。本實(shí)驗(yàn)試圖通過多角體蛋白部分多肽融合外源蛋白EGFP的表達(dá)，找到多角體高效表達(dá)的主要區(qū)域，并探索是否能降低融合蛋白的溶解的pH值，為進(jìn)一步純化其他的目的蛋白提供更為便利的條件。
　　 我們根據(jù)預(yù)測的多角體三級(jí)結(jié)構(gòu)，分別截取了不同長度的多角體基因片段，在表達(dá)載體pET-28a上構(gòu)建重組載體，然后與報(bào)告基因EGFP融合表達(dá)后，得到三種高效表達(dá)的融合

3、蛋白Ph60-EGFP、Ph120-EGFP、Ph180-EGFP，這三種蛋白有著和多角體蛋白一樣在堿性條件下(pH10.8及以上)下可溶的特殊性質(zhì)，也可以通過簡單的pH梯度洗脫和差速離心的方法純化。而且還可以通過回調(diào)pH的方法使融合蛋白在中性條件下溶解，凝血酶酶切融合蛋白也較為完全。
　　 我們利用得到的這三種多角體片段融合另外兩種膜蛋白MMGT和ABP在表達(dá)載體pET-28a上表達(dá)，與未融合多角體片段的外源蛋白相比，融合蛋白

4、得到高效表達(dá)，并且也可以通過回調(diào)pH使得融合蛋白在中性條件下可溶。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了所得到的三種多角體片段具有高效表達(dá)的性質(zhì)，且具有比全長多角體更為優(yōu)越的溶解特性。這一發(fā)現(xiàn)，可以為大量純化外源蛋白提供一種便捷的方法。
　　 本課題還在RNA水平上進(jìn)行多角體基因轉(zhuǎn)錄水平的研究，利用重組好的病毒（融合ph基因和未融合ph基因的成對(duì)重組病毒），分別感染家蠶細(xì)胞;細(xì)胞發(fā)病后，加入ActinomycinD進(jìn)行抑制基因轉(zhuǎn)錄后，分時(shí)段提

5、取細(xì)胞和病毒的總RNA;通過熒光定量PCR檢測各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外源基因的mRNA的含量;統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，得出重組基因mRNA的半衰期，探索mRNA的半衰期與高效表達(dá)的關(guān)系:在選擇的高效表達(dá)的成對(duì)重組病毒中，融合多角體基因后有的外源基因mRNA的含量增加，有的外源基因mRNA的半衰期得到延長，但不論mRNA含量還是半衰期，都少于野生多角體基因的mRNA含量和半衰期。這可能是由于表達(dá)系統(tǒng)中的環(huán)境因素對(duì)多角體mRNA自身的穩(wěn)定性有很大的幫助。融合多角