百脈根高頻再生體系的建立及兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因的轉(zhuǎn)化.pdf

1、百脈根又名牛角花、五葉草和鳥趾草，是豆科百脈根屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐、亞溫暖地帶。適應(yīng)性廣，產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)含量居豆科牧草首位，在成熟收獲后，蛋白質(zhì)含量仍可達(dá)17.4％，品質(zhì)佳，適口性好，各類家畜均喜食。根系發(fā)達(dá)，改土肥田效果和保持水土性能好。全草亦可藥用，也是很好的蜜源植物。歐洲、北美以及澳大利亞、新西蘭、日本均有栽培。我國(guó)貴州、云南、湖北、湖南、陜西省均有野生種。華南、西南、西北、華北等地均有栽培，是我國(guó)溫暖濕潤(rùn)地區(qū)極有希望的優(yōu)良牧

2、草。 兔出血癥是由兔出血癥病毒所致的一種急性、高度傳染致死性疾病，以全身實(shí)質(zhì)器官水腫、淤血及出血性變化為主要特征，其發(fā)病率和致死率都很高，是兔的一種毀滅性傳染病。該病于1984年春在中國(guó)江蘇無錫、江陰等縣市首先暴發(fā)，其后世界各養(yǎng)兔地區(qū)都相繼發(fā)生，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RHDV衣殼蛋白VP60與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)，是病毒免疫保護(hù)性抗原；另一方面，RHDV只有一個(gè)血清型，注射疫苗是預(yù)防RHD的最有效方法，但由于

3、RHDV迄今未能穩(wěn)定地適應(yīng)于任何細(xì)胞培養(yǎng)，現(xiàn)行疫苗只能用感染RHDV致死的兔肝脾組織制備組織滅活疫苗，存在著諸多弊端。而用VP60制備RHD亞單位疫苗是一個(gè)新的途徑。 本研究從植物再生體系的建立到表達(dá)載體的構(gòu)建，再到遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，比較系統(tǒng)的研究了以百脈根作為植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)RHDV口服疫苗的相關(guān)成套技術(shù)，為利用轉(zhuǎn)基因百脈根作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)兔出血癥疫苗(包括其它各種疫苗)，特別是能口服的疫苗建立初步的技術(shù)基礎(chǔ)。

4、對(duì)百脈根組織培養(yǎng)的研究，國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)方法，力求全面、準(zhǔn)確的研究百脈根植株再生系統(tǒng)，以期增加可行性和提高再生效率。以MS為基本培養(yǎng)基，以下胚軸、子葉、莖、真葉為外植體，通過調(diào)整激素種類與濃度等培養(yǎng)條件，研究不同激素濃度組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及根再生的影響。結(jié)果表明，MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基可高效誘導(dǎo)愈傷組織的形成，以下胚軸為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織呈深綠色，結(jié)構(gòu)

5、較緊密，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，為再生性的愈傷組織，為最適合的誘導(dǎo)外植體，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽的分化，速度快而且單個(gè)外植體叢生芽的分化個(gè)數(shù)也要多于其它培養(yǎng)基，為最優(yōu)的誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基，MS +NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基能快速誘導(dǎo)根的生成，形成再生植株。以植物表達(dá)載體 pBI121 為基本框架構(gòu)建植物表達(dá)載體 VP60-pBI121。用 Xba Ⅰ和Sac Ⅰ分別雙酶切載體 pGEM-T eas

6、y (克隆有VP60基因)和 pBI121，回收 pBI121 大片段和 VP60基因片段，過夜連接，轉(zhuǎn)化、篩選得到陽性克隆，經(jīng) PCR、酶切和測(cè)序鑒定后，證明VP60基因已連接到pBI121載體上以已經(jīng)建立起來的再生體系為基礎(chǔ)，以農(nóng)桿菌 LBA4404 (含質(zhì)粒 VP60-pBI121) 為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化百脈根，來探索百脈根的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，外植體預(yù)培養(yǎng) 3 d，在OD600 為 0.6 的菌夜中浸染 20 min，共培養(yǎng)3 d