兔病毒性出血癥病毒YL株VP60基因的克隆與生物信息分析及原核表達(dá)與轉(zhuǎn)化串葉松香草研究.pdf

1、兔出血癥(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus，RHDV)所致的兔的一種急性、高度傳染性、高度致死性的疾病，以兔全身實(shí)質(zhì)器官水腫、淤血及出血性變化為主要特征。其發(fā)病率和致死率都很高，被感染的成年兔基本上在48～72 h內(nèi)死亡，是兔的一種毀滅性傳染病。該病自1984年于中國江蘇省首先暴發(fā)后迅速流行蔓延開，迄今為止，中國的幾乎所有省份

2、都有：RHDV流行的報(bào)道，在國外各養(yǎng)兔地區(qū)也存在和流行，是養(yǎng)兔業(yè)的嚴(yán)重威脅。 為了研究西北地區(qū)的RHDV分子生物學(xué)特征和RHDV病毒流行規(guī)律，我們應(yīng)用RT-PCR方法從RHDV西北分離株YL中克隆出衣殼蛋白VP60基因并測序，測序結(jié)果顯示VP60基因全長1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸，序列在GenBank中注冊(登錄號為DQ530363)。YL株是中國西北地區(qū)首株被測序的RHDV。從GenBank里下載全部已發(fā)表的其它39

3、株RHDV序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸序列同源性表，結(jié)果表明世界不同地區(qū)RHDV分離株基因序列雖然非常保守，達(dá)到90％以上，但可以分為5個(gè)基因群，并且基因型和地域性沒有必然聯(lián)系，中國的分離株除了WX84株外，其它均處于第V基因群，該基因群內(nèi)近年分離出的中國四個(gè)不同大地區(qū)(西北、華東、東北、西南)的RHDV毒株與NJ85株遺傳距離很近，很可能都來自同一毒株NJ85。同時(shí)，對四個(gè)不同大地區(qū)的近年的四個(gè)代表性分離株的二

4、級結(jié)構(gòu)、抗原性進(jìn)行了預(yù)測分析，結(jié)果顯示二級結(jié)構(gòu)有一定差異，但抗原性相同，這與RHDV只有一個(gè)血清型相一致。 同時(shí)為在原核中高效表達(dá)兔出血癥病毒(RHDV)VP60衣殼蛋白，以研究RHD亞單位疫苗，我們構(gòu)建了YL株VP60基因原核表達(dá)載體VP60-pET32a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析顯示，VP60融合蛋白分子量為75 kD，其占總菌體蛋白的表達(dá)量達(dá)398％。Westem

5、 blot分析表明，VP60融合蛋白可以和RHDV TP株抗血清特異反應(yīng)。本研究顯示兔出血癥病毒在干旱半干旱條件下的遺傳變異和免疫學(xué)特征沒有較大變化。 我們通過對串葉松香草不同激素濃度配比的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，建立了串葉松香草離體培養(yǎng)高效再生體系，結(jié)果表明：MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)培養(yǎng)基可高效誘導(dǎo)愈傷組織和芽的分化，1/2MS+IBA(0.1mg/L)培養(yǎng)基可快速誘導(dǎo)根的生成，形成再生植株。構(gòu)建了植物