兔出血癥病毒單克隆抗體的制備與鑒定及其衣殼蛋白VP60基因表達產物的免疫活性鑒定.pdf

1、用提純的兔出血癥病毒(RHDV)——RH-84分離株的病毒子和大腸桿菌表達的兩種VP60重組融合蛋白作為免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫脾細胞與SP2/0融合,制備雜交瘤細胞.以RHDV作為檢測原,用間接ELISA方法檢測,采取有限稀釋法亞克隆3次,初步篩選出10株針對RHDV的陽性雜交瘤細胞株,其中由pET5a-RHDV-VP60重組蛋白免疫制備的有3株:5/C4、6/F10、D/3,由pET5a-RHDV-VP60重組蛋白免疫制

2、備的有2株:5/B11、3/B5,由純化的完整病毒粒子免疫制備的有5株:RH-1、RH-2、16D6-1、16D6-2、16F2.經過4次亞克隆,發(fā)現(xiàn)由純化的完整病毒粒子免疫制備的5株單克隆抗體ELISA陽性值高、性質穩(wěn)定,無為IgG(n),而由VP60重組蛋白制備的5株單抗ELISA陽性值不高,且多為IgM,考慮到實際應用的意義,對這5株雜交瘤細胞液氮凍存,留待以后繼續(xù)研究,故只對由純化的完整病毒粒子免疫制備的5株特異性單抗進行了以下

3、研究.通過HI試驗,鑒定RH-1、RH-2有較高的血凝抑制能力(7log2、8Log2),16D6-1、16D6-2、16F2血凝抑制能力則較弱(2 log2、3 log2).經Western-blot分析,這5株單抗除RH-1外,其他4株RH-2、16D6-1、16D6-2、16F2均和非熱變性RHDV VP60反應,5株單抗均能識別熱變性RHDV多肽條帶.又通過DOT-ELISA和TAS-ELISA試驗,結果表明5株單抗均是針對兔出

4、血癥病毒粒子的特異性單克隆抗體,而不與其他抗原(兔肝組織、新城疫病毒及禽流感病毒)發(fā)生反應.以上研究結果為5株單抗的廣泛應用奠定了堅實的理論基礎.該研究又用兩種表達產物分別免疫小鼠,以RHDV完整病毒子作為檢測原對制備的多抗血清進行間接ELISA和HI檢測;結果兩種重組蛋白的鼠多抗血清ELISA反應均為陽性(P/N>2.1),OD<,490>平均值分別為0.50、0.33,且血凝抑制價分別為4 Log2、3 Log2;進一步表明VP60

5、基因的大腸桿菌表達產物具有原病毒的抗原性和免疫原性,能誘發(fā)小鼠產生針對RHDV的免疫反應.我們又借助于兔抗RHDV自然感染多抗血清與2種重組蛋白進行Western-blot分析,結果兩種重組蛋白均被兔抗RHDV多抗血清識別.以上試驗結果表明,RHDV衣殼蛋白VP60基因的大腸桿菌表達產物——pET5a-RHDV-VP60重組蛋白(62kd)和pGEX-6P-RHDV-VP60重組蛋白(87kd)具備RHDV的免疫生物學特性,且pET5a