兔瘟病毒的VP60截段基因原核表達及抗體檢測金標試紙的初步研究.pdf

1、兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)又稱兔瘟，是一種能夠引起家兔出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀以及快速死亡的一種急性高致病性傳染病。兔群一旦感染，發(fā)病率和死亡率均可高達100％，是嚴重影響?zhàn)B兔業(yè)健康發(fā)展的重要兔病之一。
　　本研究根據(jù)已發(fā)表RHDV基因組序列，針對VP60基因前900 bp片段(AB區(qū))設計兩條表達引物，通過RT-PCR擴增、酶切、連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pColdTF-VP60，轉(zhuǎn)化到

2、BL21感受態(tài)細胞中，挑取陽性菌擴大培養(yǎng)，用IPTG(1mmol/L)進行誘導表達和條件優(yōu)化，收集誘導表達菌體進行SDS-PAGE分析和Western-blotting鑒定，并進行重組蛋白的Ni-TED親和層析法純化和其反應原性ELISA檢測。結(jié)果構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pCold TF-VP60在濃度為1mmol/L IPTG，誘導表達3-4h可獲得約85.3 kD大小重組蛋白，表達重組蛋白的間接ELISA結(jié)果表明表達的重組蛋白能與免疫陽性

3、RHDV抗體特異性結(jié)合特性，具有良好的反應活性。
　　以羊抗兔IgG和鼠抗重組蛋白IgG分別標記T線和C線設計RHDV抗體檢測試紙條，通過膠體金的制各、重組VP60蛋白標記、鼠源重組VP60抗體的制備，T線和C線蛋白用量的優(yōu)化，特異性和敏感性實驗，初步試制了可用于兔抗RHDV抗體檢測的免疫膠體金試紙條，結(jié)果顯示研制的膠體金試紙條具有良好的靈敏性和特異性，其免疫血清靈敏度可達到1∶16;除了兔抗RHDV血清的檢測線出現(xiàn)紅色條帶外，其