兔瘟病毒的VP60截段基因原核表達(dá)及抗體檢測金標(biāo)試紙的初步研究.pdf

1、兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)又稱兔瘟，是一種能夠引起家兔出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀以及快速死亡的一種急性高致病性傳染病。兔群一旦感染，發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)100％，是嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)健康發(fā)展的重要兔病之一。
　　本研究根據(jù)已發(fā)表RHDV基因組序列，針對(duì)VP60基因前900 bp片段(AB區(qū))設(shè)計(jì)兩條表達(dá)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增、酶切、連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pColdTF-VP60，轉(zhuǎn)化到

2、BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用IPTG(1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blotting鑒定，并進(jìn)行重組蛋白的Ni-TED親和層析法純化和其反應(yīng)原性ELISA檢測。結(jié)果構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-VP60在濃度為1mmol/L IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)3-4h可獲得約85.3 kD大小重組蛋白，表達(dá)重組蛋白的間接ELISA結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白能與免疫陽性

3、RHDV抗體特異性結(jié)合特性，具有良好的反應(yīng)活性。
　　以羊抗兔IgG和鼠抗重組蛋白IgG分別標(biāo)記T線和C線設(shè)計(jì)RHDV抗體檢測試紙條，通過膠體金的制各、重組VP60蛋白標(biāo)記、鼠源重組VP60抗體的制備，T線和C線蛋白用量的優(yōu)化，特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)，初步試制了可用于兔抗RHDV抗體檢測的免疫膠體金試紙條，結(jié)果顯示研制的膠體金試紙條具有良好的靈敏性和特異性，其免疫血清靈敏度可達(dá)到1∶16;除了兔抗RHDV血清的檢測線出現(xiàn)紅色條帶外，其