重組表達兔瘟病毒VP60蛋白的巴氏桿菌突變株的構(gòu)建.pdf

1、兔病毒性出血癥和兔巴氏桿菌病是以高發(fā)病率和高致死率為特點的兩種接觸性傳染病，它們對家兔養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損害。疫苗免疫是防控這兩種傳染病的主要策略，目前在市場上使用最廣泛的為兔瘟組織滅活苗和巴氏桿菌滅活疫苗以及弱毒疫苗，兔瘟組織滅活苗的主要缺陷是在疫苗制備過程中可能存在的散毒風(fēng)險，以及制作成本較高且疫苗成分復(fù)雜;兔巴氏桿菌滅活苗的缺陷是對不同血清型缺乏有效的交叉保護力，而兔巴氏桿菌弱毒疫苗多采用化學(xué)突變法，背景不明。如今，越來越多的

2、學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向兔瘟病毒和兔巴氏桿菌新型疫苗的研發(fā)上，希望能研制出一種安全有效的疫苗。
　　CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)可通過切割基因組而達到基因編輯的目的。盡管gDNA/NgAgo基因編輯系統(tǒng)并不能介導(dǎo)真核細胞基因組的切割，但本實驗室已有研究應(yīng)用該系統(tǒng)及同源重組原理成功構(gòu)建了多株巴氏桿菌基因缺失株，即△lyi-GXPM、△opa-GXPM、△hyae-GXPM、△pilia-GXPM和△fhgb-GXPM，該研究成功的驗證

3、了NaAgo/gDNA基因編輯系統(tǒng)在巴氏桿菌中操作的可行性。因此，本研究擬通過gDNA/NgAgo基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)巴氏桿菌中毒力基因lyi的敲除，同時實現(xiàn)RHDVVP60蛋白該菌株中的表達，從而為兔瘟兔巴氏二價基因工程苗的研制提供新的思路。
　　首先，本研究用獲取的病料感染兔，重復(fù)出了典型的兔瘟感染臨床癥狀;其次，提取病毒RNA反轉(zhuǎn)后對VP60基因進行擴增測序，確認該病料中含有RHDV。然后，為了實現(xiàn)VP60蛋白在巴氏桿菌中高效表

4、達，對該序列進行密碼子優(yōu)化，同時將四個基因(asnA、Crp、Kana、mreB)的啟動子連接VP60基因構(gòu)建表達盒，并在其兩端構(gòu)建lyi基因左右同源臂后將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化入巴氏桿菌，通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)，asnA、Crp及Kana基因啟動子能實現(xiàn)VP60蛋白在巴氏桿菌中的表達。最終成功構(gòu)建了VP60表達且lyi基因敲除的巴氏桿菌基因工程菌株。
　　本研究成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達RHDV VP60蛋白的巴氏桿菌基因缺失株，后