基于鈣羧酸熒光淬滅原理的磷酸化蛋白檢測.pdf

1、目的：
　　蛋白質組學目前在生命科學領域中擁有其特殊而重要的地位，關于各類蛋白與疾病的關系研究也成為了眾多科研工作者研究的熱點，其中，磷酸化蛋白在許多交叉學科中經常涉及，因此也產生了磷酸化蛋白質組學這一新型的蛋白質組學分支。研究的主要內容包括磷酸化蛋白質的分離與檢測，磷酸化蛋白質與疾病因子的關系研究等等。其中關于蛋白質的分離與檢測成為了后續(xù)研究的基礎，在研究過程中則經常應用到聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白與鈣羧酸熒光檢測磷酸化蛋白。

2、>　　在聚丙烯酰胺凝膠上建立一種具有快速、靈敏、特異等特點的磷酸化蛋白檢測方法，能夠在短時間內靈敏、精確、特異地檢測到磷酸化蛋白，同時可以兼容其他常規(guī)染色檢測方法，并且與質譜也具有良好的兼容性，或通過與其他儀器技術的聯(lián)用，能夠幫助解決磷酸化蛋白質組學研究過程中的薄弱環(huán)節(jié)問題即缺少特異靈敏的特異性蛋白檢測手段，從而幫助蛋白質組學研究過程中有關于蛋白質的定性、定量分析等問題的解決，起到促進磷酸化蛋白質組學的發(fā)展的作用的目的。
　　方法

3、：
　　(1)聚丙烯酰胺凝膠是目前廣泛應用的一種蛋白分離技術，可以根據蛋白質樣品的不同分子量和等電點來有效分離混合樣品中的不同蛋白，方便應用與后期的蛋白檢測及其他蛋白質組學的研究，故而成為最可靠的一種蛋白分離技術。本課題中應用在聚丙烯酰胺凝膠上（1D和2D）分離目標標準品混合蛋白和實際樣品，建立一種關于磷酸化蛋白質特異性檢測的方法。
　　(2)通過研究鈣羧酸(CCA)熒光的特性，利用鈣羧酸在不同化學微環(huán)境（多種有機試劑，不同

4、pH環(huán)境）以及與不同類型蛋白質（磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白）作用下的熒光性質的不同，經過大量的篩選，以特異性為優(yōu)先篩選條件，靈敏度為第二提高的目標，建立一種特異性的檢測磷酸化蛋白的方法。
　　(3)方法建立后，為了避免假陽性的出現(xiàn)，采取通過與Pro-Diamond(PD)試劑盒、Western Blot等現(xiàn)有實驗技術的實驗結果進行對比驗證的方法，多重證明CCA磷酸化檢測方法的特異性;通過質譜鑒定，對檢測到的蛋白條帶進行更深入的分析，

5、更具說服力地驗證CCA檢測方法的特異性、準確性，并找到相應的磷酸化修飾位點。
　　結果：
　　1.成功建立了一種快速、特異、靈敏的以CCA熒光淬滅原理為基礎的檢測方法，詳細步驟如下:
　　(1)染色:將電泳之后的凝膠放置于50 mL含有50μM鈣羧酸（母液溶解于水中），20％1，2-丙二醇，0.5％醋酸的染色液中染色25min;
　　(2)脫色:將染色完畢的凝膠放置于50 mL含有80μM AL3+，10％甘油，

6、100 mM醋酸鈉脫色液中脫色20 min。
　　(3)通過成像裝置，在一定的激發(fā)波長條件下拍攝圖像，儲存。
　　2.通過與PD試劑盒、Western Blot進行實驗結果對比，去磷酸化實驗進一步驗證特異性并通過質譜檢測磷酸化修飾位點等實驗，最終證明了CCA方法具有特異性較好，檢測限高，線性關系好，重現(xiàn)性好等優(yōu)點?？梢詫嶋H應用于磷酸化蛋白質組學中特異性的檢測磷酸化蛋白。
　　3.為了可以實現(xiàn)方法的產業(yè)化、市場化，我們將

7、所建立的鈣羧酸磷酸化蛋白檢測方法放置于不同氣候的不同實驗場合，在不同外界條件下進行多次的重復實驗，以保證方法的穩(wěn)定性。
　　結論：
　　CCA檢測法具有操作方便（僅2步）、檢測限低（4-8ng，好于PD試劑盒）、特異性好（優(yōu)于PD試劑）、實驗時間短(45min)等優(yōu)點，可以在短時間內特異性高靈敏的檢測到磷酸化蛋白，這正好可以幫助解決磷酸化蛋白質組學中缺少好的磷酸化蛋白檢測方法的這一問題，可為磷酸化蛋白質組學的發(fā)展提供幫助，是