TGFBI調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤惡性表型及其作用機制的實驗研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病與漿細(xì)胞的異常過度增生有關(guān)，主要表現(xiàn)為單克隆免疫球蛋白異常的過度表達(dá)。近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐步上升趨勢，傳統(tǒng)化療的中位生存期不超過3年。盡管新的抗MM藥物的應(yīng)用及自體造血干細(xì)胞移植提高了治療緩解率及生存時間，但幾乎所有MM患者因殘留細(xì)胞的持續(xù)存在導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。研究已表明MM的發(fā)生發(fā)展與癌基因過度表達(dá)以及抑制基因失活密切相關(guān)，但目前對其發(fā)生發(fā)展的精確分子

2、機制尚不清楚。因此，深入研究多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展及精確分子機制，是臨床亟待解決的問題。
　　轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因(transforming growth fa tor－beta induced gene，TGFBI)是一個細(xì)胞外基質(zhì)分子，參與細(xì)胞間通訊和信號傳遞，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞惡性增殖和侵襲能力。TGFBI在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胚胎性橫紋肌肉瘤等多種惡性腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)或缺失。研究顯示TGFBI具有抗腫瘤功能，可抑

3、制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力，提高化療藥物敏感性和療效，延長患者的生存期。TGFBI作為一個抑癌基因，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，是腫瘤基因診斷和治療的理想靶點。目前TGFBI在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)水平及與其發(fā)生、發(fā)展和作用機制尚不清楚。
　　本研究選取TGFBI為靶點，探討其在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平與臨床病理之間關(guān)系。通過構(gòu)建TGFBI慢病毒過表達(dá)載體，上調(diào)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的TGFBI表達(dá)水平，在體內(nèi)外觀察多

4、發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性表型的變化，并探討其可能作用機制。本研究旨在明確TGFBI在多發(fā)性骨髓瘤中潛在治療價值，以期為多發(fā)性骨髓瘤患者靶向治療提供新靶點。
　　實驗方法與結(jié)果：
　　第一部分、TGFBI在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其臨床意義
　　方法：選取確診多發(fā)性骨髓瘤患者94例，收集患者臨床病歷資料。采用免疫組織化學(xué)染色檢測多發(fā)性骨髓活檢組織中TGFBI蛋白表達(dá)，分析其表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者

5、臨床病理之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：TGFBI在多發(fā)性骨髓瘤中低表達(dá)或缺失，其表達(dá)水平與患者發(fā)病年齡、臨床分期和治療療效呈負(fù)相關(guān)，與患者性別無關(guān)。
　　第二部分、TGFBI過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及鑒定
　　方法：采用PCR法獲取TGFBI基因CDS全長序列，并通過瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。采用Age I限制性內(nèi)切酶，酶切GV208質(zhì)粒載體線性化，通過T4DNA連接酶將目的基因TGFBI連接至載體GV208中，構(gòu)建GV208–T

6、GFBI重組質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細(xì)菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提重組質(zhì)粒載體。采用特異性引物，經(jīng)PCR擴增含有GV208和目的基因TGFBI片段，挑取陽性克隆行DNA測序鑒定。將構(gòu)建成功的GV208-TGFBI慢病毒質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，經(jīng)過病毒包裝、收獲及濃縮，測定慢病毒液的滴度。將獲取的慢病毒液感染多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞，熒光顯微鏡下及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞感染效率。RT-PCR及western-Blot法檢測感染前

7、后多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中的TGFBI mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：采用PCR法獲取目的基因TGFBI CDS全長序列。通過連接反應(yīng)，成功將其連接至GV208慢病毒質(zhì)粒載體中，經(jīng)PCR擴增，電泳和DNA測序鑒定，成功構(gòu)建GV208-TGFBI過表達(dá)慢病毒載體。轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞后，通過病毒包裝、濃縮，測定慢病毒液的滴度為2.0×108TU/ml。將GV208-TGFBI慢病毒質(zhì)粒載體感染多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞

8、，流式細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染率均在90%以上。采用RT-PCR及Western-blot法檢測感染前后TGFBI mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)：感染慢病毒GV208-TGFBI組第48h，多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中TGFBI mRNA的表達(dá)明顯升高，其表達(dá)量較感染空載慢病毒GV208組提高了4.8和4.6倍，與未感染組及感染空載慢病毒GV208組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　第三部分、TGFBI基因調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞惡

9、性表型及其作用機制的體外實驗研究
　　方法：實驗分為兩組：GV208組為對照組，GV208-TGFBI組為實驗組。將上述成功構(gòu)建的慢病毒重組質(zhì)粒感染多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力，Western blot法檢測多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：CCK-8及流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示：G

10、V208-TGFBI組中多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖能力明顯低于GV208組，隨著時間延長，差異更明顯；G0/G1期細(xì)胞比例增多，而S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡明顯增加，達(dá)到35.02%，與GV208組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示：GV208-TGFBI組中的多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量為98±7個/視野，而GV208組的穿膜細(xì)胞數(shù)為255±12個/視野，差異也具有統(tǒng)計學(xué)

11、意義（P＜0.05）。同時GV208-TGFBI組多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的CyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，與GV208組相比，其蛋白表達(dá)水平分別抑制了59.0%，67.4%及80.0%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第四部分、TGFBI基因調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤裸鼠移植瘤惡性表型及其作用機制的體內(nèi)實驗研究
　　方法：將感染GV208和GV208-TGFBI多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)

12、胞接種于動物皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。觀察腫瘤細(xì)胞生長、測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積和腫瘤抑瘤率。透射電鏡觀察腫瘤組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，Western blot法檢測腫瘤組織中TGFBI、PCNA、CyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。GV208組及GV208-TGFBI組細(xì)胞成瘤時間分別為6天和10天。GV208-TGFBI組多發(fā)性骨髓瘤裸鼠移植瘤生長

13、速度緩慢，隨著時間延長，腫瘤體積較小，重量較輕，其抑瘤率達(dá)到了62.03%。透射電鏡結(jié)果顯示：GV208-TGFBI組多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡等形態(tài)改變增加，腫瘤細(xì)胞增殖能力下降。GV208-TGFBI組的多發(fā)性骨髓瘤組織中TGFBI蛋白表達(dá)顯著升高，其蛋白表達(dá)提高了3.74倍，而PCNA、CyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表達(dá)明顯降低，蛋白表達(dá)分別抑制了52.1%、55.1%、71.4%及77.8%，差異均具有統(tǒng)計