γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs向肺泡上皮細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來(lái)源廣、易培養(yǎng)且具有誘導(dǎo)其定向分化目的細(xì)胞的潛能，在BMSCs分化的過(guò)程中有許多信號(hào)通路參與并發(fā)揮重要的作用，而Notch信號(hào)通路就是其中的一條。本實(shí)驗(yàn)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與肺泡上皮細(xì)胞（MLE-12）進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)中加入γ-分泌酶抑制劑(DAPT)觀察其對(duì)BMSCs分化過(guò)程產(chǎn)生的影響，明確γ-分泌酶抑制劑（DAPT）阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs誘導(dǎo)分化肺泡

2、上皮細(xì)胞過(guò)程中的影響。
　　方法：
　　取4周左右的小鼠脛骨及股骨，采用全骨髓貼壁細(xì)胞法進(jìn)行分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取第3代的骨髓充質(zhì)干細(xì)胞采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。將純化后的第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞在Transwell體系下進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入γ-分泌酶抑制劑DAPT。本實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：空白對(duì)照組即為低糖培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化組、加入

3、DAPT20ng/ml干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化組。處理后用光鏡觀察共培養(yǎng)后BMCSs的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并分別在共培養(yǎng)的第10天提取蛋白及RNA,用Western和RT-qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1、HES1，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞特異性表面活性蛋白（surfactant protein C，SPC）、Ι型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志水通道蛋白（aquaporin5，AQP5）的表達(dá)含量以此評(píng)估γ-分泌酶抑制劑DA

4、PT抑制Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs向肺泡上皮細(xì)胞分化的作用。
　　結(jié)果：
　　1.分離后BMSCs在光鏡下可觀察到其形態(tài)為短梭形，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45表達(dá)陰性，表明已成功提取到BMSCs.
　　2.在光鏡下觀察共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的BMSCs由梭形逐漸變?yōu)樗其伮肥瘶由掀ぜ?xì)胞形態(tài)。
　　3. Notch信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞分化時(shí)被激活，和空白對(duì)照組相比，N

5、otch1蛋白表達(dá)和HES1mRNA表達(dá)升高（p<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在BMSCs與MLE-12進(jìn)行共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入抑制劑DAPT濃度為20ng/ml后，和共培養(yǎng)組相比，Notch1蛋白和HES1mRNA的表達(dá)減少（p<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的過(guò)程中γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠阻斷Notch信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)。
　　4.在共培養(yǎng)組、DAPT共培養(yǎng)組中將細(xì)胞培養(yǎng)10天后，經(jīng)Western和RT-

6、qPCR可檢測(cè)到 SPC、AQP5蛋白和mRNA。和空白對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組和DAPT共培養(yǎng)組中SPC、AQP5蛋白及其mRNA的表達(dá)升高（p<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DAPT共培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組相比，SPC、AQP5蛋白及其mRNA的表達(dá)減少(p<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在MLE-12誘導(dǎo)下可以定向分化為肺泡上皮細(xì)胞
　　2.BMSCs在MLE-12誘導(dǎo)定向分化肺泡上皮