Ghrelin抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡及其信號(hào)通路.pdf

1、目的
　　 研究ghrelin是否能夠抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,觀察一些凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,并進(jìn)一步探討ghrelin是否通過(guò)PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡。
　　 方法
　　 1.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株上是否有GHS-R1a的表達(dá)。
　　 2.將細(xì)胞分為對(duì)照組和處理組,處理組細(xì)胞由5-Fu(80μM)單獨(dú)或與ghrelin(10-9M-10-6M)共同

2、處理24h-48h。
　　 3.通過(guò)MTT法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)活性的檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞生存率。
　　 4.通過(guò)DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞核的形態(tài)。
　　 5.通過(guò)Annexin V/PI雙染色后行流式細(xì)胞術(shù),測(cè)定并比較各組細(xì)胞的凋亡率。
　　 6.通過(guò)Western-blot觀察凋亡相關(guān)蛋白caspase3、bcl-2、bax及信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Akt、P-Akt、ERK1/1、P-ERK1/2的表達(dá)

3、水平在各組中的變化。
　　 結(jié)果
　　 1.RT-PCR檢測(cè)到HT-29細(xì)胞上有GHS-R1a的表達(dá)。
　　 2.MTT法顯示ghrelin呈劑量依賴性地降低了5-Fu引起的HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,提高了細(xì)胞生存率(P＜0.05)。
　　 3.DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)發(fā)現(xiàn)5-Fu單獨(dú)處理的細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、核皺縮、核破裂等典型的凋亡改變,而ghrelin減少了這種改變。
　　

4、4.Annexin V-FITC/PI雙染色后行流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)到ghrelin呈劑量依賴性地降低了5-Fu引起的細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)。
　　 5.共同處理組與5-Fu單獨(dú)處理組相比:caspase3活性降低,bcl-2表達(dá)增加而bax表達(dá)下降,Akt和ERK被激活,P-Akt和P-ERK表達(dá)增加。
　　 結(jié)論
　　 Ghrelin能夠抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,并可能通過(guò)PI3K/Akt及ERK1/2信號(hào)通路介