阻斷W-β-catenin信號通路對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的作用.pdf

1、背景和目的：
　　 各種不同病因的慢性腎臟病的發(fā)展最終均以漸進性的腎小管間質(zhì)纖維化和腎功能衰竭為基本特征，腎小管間質(zhì)纖維化為其最后的共同病理學改變，表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細胞的增生及細胞外基質(zhì)的沉積。研究證明，腎小管上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要的作用，EMT是指在腎小管上皮細胞在病理因素的刺激下，失去上皮細胞的特征，表現(xiàn)為肌

2、成纖維細胞特性。
　　 Wnt信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，在細胞的黏附、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、生長、分化、凋亡以及在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和維持組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白在腎間質(zhì)纖維化動物模型中表達升高，但Wnt/β-catenin信號通路在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用機制仍不清楚。
　　 本研究體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞(human proxi

3、mal tubular epithelial cells，HKCs)，采用Wnt阻滯劑Dickkopf-1(Dkk-1)及構(gòu)建的β-catenin短發(fā)卡干擾RNA(shorthairpin RNA，shRNA)從兩個水平上阻斷Wnt/β-catenin信號通路，觀察其對腎小管上皮細胞EMT的影響，探討其在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為抗腎小管間質(zhì)纖維化治療尋找新的干預靶點提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將體

4、外培養(yǎng)的HKC細胞分為對照組、TGF-β1組(TGF-β1終濃度為20ng/ml)和TGF-β1+Dkk-1組(TGF-β1、Dkk-1終濃度分別為20ng/ml、100ng/ml)，培養(yǎng)48小時后RT-PCR及Western blot檢測細胞Wnt4、β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表達，細胞免疫熒光染色觀察E-cadherin和α-SMA的表達。
　　 2.根據(jù)shRNA設計原則，設計針對

5、β-catenin基因的3個干擾靶點，合成序列片段，構(gòu)建β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)鑒定片段成功插入后，以LipofectamineTM2000將空白質(zhì)粒、重組的三個干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TGF-β1(終濃度為20ng/ml)誘導的HKC細胞，48小時后檢測轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Western blot檢測各組細胞β-catenin的mRNA及蛋白表達，挑選對β-catenin基因抑制效果最好的β-catenin-shRNA干擾質(zhì)

6、粒。
　　 3.將HKC細胞分4組：①對照組，含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；②TGF-β1組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)；③TGF-β1+轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)，該組轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒；④TGF-β1+轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)，該組轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒；各組細胞按照分組處理或以LipofectamineT

7、M2000轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，培養(yǎng)48h后在倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，RT-PCR及Western blot檢測細胞β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表達，細胞免疫熒光染色觀察E-cadherin和α-SMA的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.Wnt阻滯劑Dickkopf-1(Dkk-1)對HKC細胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 Wnt4在對照組幾乎沒有表達，在TGF-β1組和TGF-β1+Dk

8、k-1組顯著上調(diào)；β-catenin的mRNA在對照組、TGF-β1組和TGF-β1+Dkk-1組均有較高的表達，組間沒有明顯差異，β-catenin的蛋白在對照組低水平表達，在TGF-β1組明顯上調(diào)，在TGF-β1+Dkk-1組表達顯著下調(diào)；E-cadherin的在對照組高表達，在TGF-β1組表達顯著降低，在TGF-β1+Dkk-1組表達明顯上調(diào)；α-SMA的表達與E-cadherin的表達相反，在對照組表達很低，在TGF-β1組表

9、達顯著上調(diào)，在TGF-β1+Dkk-1組表達較TGF-β1組明顯下調(diào)。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，E-cadherin在對照組高表達，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，在TGF-β1組表達降低綠色熒光表達減弱，在TGF-β1+Dkk-1組的表達較TGF-β1組明顯表達升高，綠色熒光較TGF-β1組增強；α-SMA的紅色熒光表達完全同E-cadherin相反。
　　 2.β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選
　　 構(gòu)建的β-ca

10、tenin-shRNA干擾質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定證實設計片段完全插入；按照LipofectamineTM2000說明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒，通過熒光顯微鏡及流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率為60%左右，組間沒有明顯差異，達到實驗要求；RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示，3個轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒組β-catenin的mRNA及蛋白表達較轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均顯著降低，其中β-catenin-shRNA-1干擾質(zhì)粒對β-

11、catenin的抑制效果最佳。
　　 3.shRNA干擾β-catenin對HKC細胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 β-catenin的mRNA在對照組、TGF-β1組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均高表達，組間無差異，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組表達顯著降低?？偟鞍爪?catenin在對照有較低水平表達，胞核無β-catenin表達，總蛋白β-catenin在TGF-β1組表達顯著升高，胞核β-catenin也有較高表達，在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，總蛋白β-ca

12、tenin及胞核β-catenin表達同TGF-β1組高表達，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，總蛋白β-catenin表達明顯下降，胞核無β-catenin表達E-cadherin的mRNA在對照組高表達，在TGF-β1組表達顯著下降，在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，同TGF-β1組一致表達顯著下降，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組其表達顯著上升；α-SMA的mRNA在對照組幾乎沒有表達，在TGF-β1組表達明顯升高，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組α-SMA的mRNA表達同TGF-β1組一致表達

13、明顯升高，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，α-SMA的mRNA顯著下降。細胞免疫熒光顯示，E-cadherin在對照組為明亮的綠色熒光，在TGF-β1組綠色熒光表達減弱，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組表達同TGF-β1組，綠色熒光表達減弱，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，綠色熒光較TGF-β1組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組顯著增強；α-SMA的紅色熒光表達完全同E-cadherin相反。
　　 結(jié)論：
　　 1.Wnt/β-catenin信號通路參與HKC細胞轉(zhuǎn)分化，Wnt阻