養(yǎng)血清腦顆粒改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年來，癡呆癥逐漸成為全球的主要威脅之一。血管性癡呆（Vasculardementia,VD）是繼阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sDisease,AD）之后第二位最常見的癡呆病因，目前有臨床研究證實(shí)養(yǎng)血清腦顆?？筛纳芕D患者的認(rèn)知功能，然而，相關(guān)的作用機(jī)制探索中對神經(jīng)細(xì)胞自噬及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控關(guān)注甚少。本實(shí)驗(yàn)通過干預(yù)雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎制作VD大鼠模型，觀察VD大鼠術(shù)后應(yīng)用養(yǎng)血清腦顆粒治療對認(rèn)知功能的改善作用，并進(jìn)一步探

2、討其是否與JNK/Bcl-2通路介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬有關(guān)。
　　方法：3月齡250-300g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠為研究對象，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（bilateralcarotidarteryligation,2-VO）的方法建立VD大鼠模型。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組（Sham+Saline）、模型組（2VO+Saline）、養(yǎng)血清腦低劑量治療組（2VO+CG0.4）、養(yǎng)血清腦高劑量治療組（2VO+CG0.

3、8），術(shù)后連續(xù)灌胃給藥28天，日一次，假手術(shù)組及模型組給予適量的生理鹽水灌胃。
　　連續(xù)給藥28天后進(jìn)行行為學(xué)測試，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，觀察各組大鼠空間認(rèn)知能力的變化。水迷宮測試結(jié)束后，采用尼氏染色觀察各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化。丙二醛（Malondialdehyde,MDA）測試盒及總超氧化物歧化酶（Totalsuperoxidedismutase,T-SOD）測試盒檢測各組大鼠海馬組織MDA含量及SOD活性。應(yīng)用W

4、esternblot檢測各組大鼠海馬組織中JNK、p-JNK、p-bcl-2及自噬相關(guān)因子Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Beclin1和p62陽性細(xì)胞數(shù)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1、水迷宮結(jié)果
　　1.1定位航行實(shí)驗(yàn)
　　各組大鼠的逃避潛伏期（即入水到找到平臺(tái)的時(shí)間）隨訓(xùn)練天數(shù)逐漸縮短。第1天，各組大鼠的逃避潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第2至5天

5、，模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）。與模型組大鼠相比，養(yǎng)血清腦治療組大鼠的逃避潛伏期均明顯縮短（第3天P＜0.05，其余P＜0.01）。
　　1.2空間探索實(shí)驗(yàn)
　　與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠在目標(biāo)象限（即原平臺(tái)所在象限）停留時(shí)間百分比比值偏低（P＜0.01），而養(yǎng)血清腦治療組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比較模型組大鼠明顯增加（P＜0.05），且高劑量治療組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比比值高于低

6、劑量治療組大鼠（P＜0.05）。
　　2、尼氏染色結(jié)果
　　假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整且排列緊密，胞漿清亮，細(xì)胞核清晰可見。與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列疏松，有缺失現(xiàn)象，部分神經(jīng)元可見胞體及胞核固縮。養(yǎng)血清腦顆粒治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失有所減少，仍存在胞核固縮現(xiàn)象。
　　3、MDA含量及SOD活性檢測結(jié)果
　　與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠MDA含量顯著增加(P＜0.0

7、1)，養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠MDA含量有所下降(P＜0.01)，高劑量治療組大鼠MDA含量低于低劑量治療組(P＜0.01)。
　　與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠SOD活性顯著降低(P＜0.01)，養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠SOD的活性有所增高(P＜0.01)，高劑量治療組較低劑量治療組大鼠SOD活性更高(P＜0.01)。
　　4、Westernblot結(jié)果
　　4.1VD大鼠海馬組織中JNK、p-JNK、p

8、-bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的表達(dá)：
　　與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠海馬組織JNK蛋白表達(dá)未見明顯差異，p-JNK、p-bcl-2及Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯增加，LC3-II/I比值升高，p62蛋白表達(dá)顯著下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　4.2養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠海馬組織JNK、p-JNK、p-bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的影響：
　　養(yǎng)血清腦

9、治療組大鼠與模型組大鼠相比，JNK蛋白表達(dá)未見明顯差異，p-JNK蛋白表達(dá)水平下降，且p-bcl-2、Beclin1蛋白表達(dá)明顯減少，LC3-II/I比值下降，p62蛋白表達(dá)顯著增加，高劑量治療組大鼠較低劑量治療組大鼠變化更明顯（P＜0.01）。
　　5、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　5.1Beclin1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果：
　　Beclin1陽性細(xì)胞呈棕黃色,于細(xì)胞漿表達(dá)。與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞

10、數(shù)明顯增多（P＜0.01），養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01）。
　　5.2p62陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果：
　　p62陽性細(xì)胞呈棕黃色,于細(xì)胞漿表達(dá)。與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)明顯偏少（P＜0.01），養(yǎng)血清腦顆粒治療組大鼠較模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）。
　　結(jié)論：養(yǎng)血清腦顆?？梢宰鳛榭寡趸瘎p輕VD大鼠海馬區(qū)氧化損傷，改善慢性腦灌