血管性癡呆大鼠腦5-HT6受體表達(dá)變化與認(rèn)知功能障礙的研究.pdf

1、背景:
　　血管性癡呆(Vascular Dementia,VaD)是各種腦血管病引起的智能障礙綜合征,多繼發(fā)于腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等,其在老齡人群癡呆中的發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)。發(fā)病機(jī)理與缺血性腦損傷所致神經(jīng)元退行性變、凋亡或壞死等相關(guān),更深入的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未明確。臨床治療原則是控制危險(xiǎn)因素,包括高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、吸煙、抗血小板聚集藥物治療以及預(yù)防腦卒中等,缺乏

2、特異性藥物治療,膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase Inhibitor,AchEI)和NMDA受體拮抗劑作為國(guó)外指南推薦的一線治療藥物,能在一定程度上緩解VaD癥狀。雖然VaD和AD具有相似的心腦血管危險(xiǎn)因素并都能受益于膽堿酯酶抑制劑的治療,但兩者的臨床特點(diǎn)不同而且膽堿酯酶抑制劑用于VaD的治療效果并不如AD的有效,提示VaD發(fā)病機(jī)制中存在與AD不同的受體-遞質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常。
　　5-HT6受體(5-HT6R

3、)屬于5-羥色胺受體超家族,幾乎僅分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在大鼠以嗅束、前額葉、內(nèi)嗅皮層、背側(cè)海馬(包括齒狀回、CA1區(qū)、CA2區(qū)和CA3區(qū))、伏核、紋狀體等部位的分布密度較高,該受體對(duì)乙酰膽堿、谷氨酸、去甲腎上腺素、腎上腺素等多種神經(jīng)遞質(zhì)的分泌具有調(diào)節(jié)作用,參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知和情感等生理活動(dòng)。對(duì)阿爾茨海默病病人的尸體解剖發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)額葉和顳葉皮層5-HT6受體較同齡人表達(dá)下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)5-HT6R拮抗劑能逆轉(zhuǎn)抗膽堿能藥物(如東

4、莨菪堿)引起的記憶缺損,而抑制該受體表達(dá)可以促進(jìn)腦內(nèi)乙酰膽堿釋放,進(jìn)一步支持5-HT6R在中樞記憶與認(rèn)知過程中的潛在作用。隨著高選擇性、血-腦屏障通透性好的5-HT6R配體藥物的研制成功,越來越多神經(jīng)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)5-HT6受體拮抗劑具有提高動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶能力和改善認(rèn)知功能的作用。目前,已經(jīng)開展5-HT6受體拮抗劑SB-742457、SGS518、SAM513等分別單獨(dú)或與膽堿酯酶抑制劑合并治療認(rèn)知障礙相關(guān)性疾病的Ⅱ期臨床試驗(yàn),其抗癡呆

5、的機(jī)制研究亟待進(jìn)一步完善。如今,尚未有關(guān)于血管性癡呆發(fā)病后腦內(nèi)5-HT6受體表達(dá)變化的研究報(bào)道,而血管性癡呆是老年人認(rèn)知障礙疾病中唯一有希望防治的癡呆類型,因此對(duì)于5-HT6受體表達(dá)改變與血管性癡呆發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。
　　目的:
　　本課題以大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷建立血管性癡呆模型,觀察慢性腦缺血后的大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力、腦組織病理改變與5-HT6R及其mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化;觀察選擇性5-HT6拮抗劑SB-

6、399885對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)、5-HT6R及其mRNA表達(dá)的干預(yù)作用,探討5-HT6R表達(dá)改變?cè)谘苄园V呆發(fā)病機(jī)制的潛在作用。
　　方法:
　　1、動(dòng)物分組及血管性癡呆動(dòng)物模型建立
　　1.1、分組
　　120只大鼠隨機(jī)分成四組,假手術(shù)組(sham-operated group,SO group,n=40)、血管性癡呆組(vascular dementia group,VaD group,n=80)、高選擇

7、性5-HT6受體拮抗劑SB-399885處理組(VaD-SB399885 group,n=15),安慰劑對(duì)照組(VaD-Placebo group,n=15)。
　　1.2、建立大鼠血管性癡呆模型(Bilateral Common Carotid Arteries occlusion,BCCAo)水合氯醛麻醉后,大鼠頸前正中作一縱形切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用1號(hào)絲線雙重結(jié)扎,假手術(shù)組大鼠只分離但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
　　1.

8、3、藥物干預(yù)VaD-SB399885組大鼠在BCCAo術(shù)后24小時(shí)每日腹腔注射選擇性5-HT6受體拮抗劑SB-399885(3.0mg/Kg.d),連續(xù)給藥4周;VaD-Placebo組給予等體積生理鹽水腹腔注射。
　　2、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察
　　觀察慢性腦缺血對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶的影響以及5-HT6R拮抗劑SB-399885對(duì)空間學(xué)習(xí)、記憶障礙的干預(yù)作用
　　假手術(shù)組和VaD組在BCCAo術(shù)后4周和8周、V

9、aD-Placebo組和VaD-SB399885組在藥物干預(yù)(4周)結(jié)束后24小時(shí)分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),記錄定位航行試驗(yàn)中大鼠找到逃生平臺(tái)的平均逃避潛伏期(Mean Escape Latency Time,MELT)和空間探索試驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間(Mean Time In Target Quadrant,MTiTQ)以此評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力。
　　3、慢性腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬、皮層的神經(jīng)病理學(xué)

10、觀察
　　3.1、腦組織取材、石蠟包埋和制片
　　BCCAo術(shù)后2天、1周、4周、8周從假手術(shù)組和VaD組中分別各取5只大鼠,麻醉后經(jīng)心臟灌注固定,斷頭取腦,自視交叉后3mm處冠狀位切取約3mm厚度腦組織,梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋。
　　3.2、神經(jīng)病理學(xué)染色
　　石蠟組織作冠狀位連續(xù)切片(2μm),蘇木素-伊紅染色和尼氏染色后在光學(xué)顯微鏡高倍鏡(400×)下觀察。
　　4、RT-PCR分析腦組織5-

11、HT6RmRNA表達(dá)水平
　　觀察慢性腦缺血5-HT6RmRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及腦缺血后5-HT6受體拮抗劑SB-399885干預(yù)對(duì)5-HT6RmRNA表達(dá)水平的影響。
　　提取各組大鼠腦組織總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,按Fast Start Universal SYBR Green ROX試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系,檢測(cè)各組腦組織中5-HT6RmRNA表達(dá)水平。
　　5、免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)、皮

12、層神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)
　　觀察慢性腦缺血后5-HT6受體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及選擇性5-HT6R拮抗劑SB-399885對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)的影響。
　　石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化和高壓修復(fù)后,以EnVision酶免疫組化法檢測(cè)海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元5-HT6受體;冰凍切片作免疫熒光檢測(cè)皮層5-HT6受體。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用上海欣軟信息科技公司開發(fā)的SuperMaze

13、動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)采集Morris水迷宮中動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡;應(yīng)用Image Pro Plus圖文分析系統(tǒng)采集組織病理、免疫組化圖片及進(jìn)行免疫組化平均光密度分析。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)和Levene方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示;Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析,當(dāng)資料不滿足Mauchly’s球?qū)ΨQ性檢驗(yàn)時(shí)采用G

14、reenhouse-Geisser法校正自由度;其余正態(tài)分布資料方差齊性采用ANOVA,方差不齊采用Welch校正檢驗(yàn),多重比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn),方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、Morris水迷宮行為學(xué)分析結(jié)果
　　1.1、VaD大鼠與假手術(shù)組大鼠在定位航行試驗(yàn)中平均游泳速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示BCCAo誘導(dǎo)的血管性癡

15、呆大鼠不存在明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙。
　　1.2、術(shù)后4周和8周,在定位航行試驗(yàn)中VaD大鼠平均逃避潛伏期(MELT)較假手術(shù)組大鼠明顯延長(zhǎng)(P<0.001),在空間探索試驗(yàn)中目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間(MTiTQ)則較假手術(shù)組明顯縮短(P<0.001),提示VaD大鼠存在空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。
　　1.3、維持4周的選擇性5-HT6R拮抗劑干預(yù)處理后,在定位航行試驗(yàn)中VaD-SB399885組MELT隨訓(xùn)練而逐漸縮短的變化趨勢(shì)較VaD

16、-Placebo組明顯(P<0.01),其在空間探索試驗(yàn)Probe1、Probe2的MTiTQ較VaD-Placebo組延長(zhǎng)(P<0.05),提示5-HT6R拮抗劑SB-399885干預(yù)處理能減輕VaD大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。
　　2、海馬CA1區(qū)、皮層組織病理學(xué)觀察結(jié)果
　　在BCCAo術(shù)后2天、1周、4周和8周,血管性癡呆組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性、壞死隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重,VaD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計(jì)數(shù)

17、進(jìn)行性減少(P<0.01)。
　　3、腦5-HT6RmRNA表達(dá)水平的RT-PCR分析
　　3.1、BCCAo術(shù)后2天、1周、4周和8周,VaD組大鼠腦5-HT6RmRNA表達(dá)水平在腦缺血4周內(nèi)進(jìn)行性下降(P<0.001),以術(shù)后4周時(shí)表達(dá)下降最為顯著,術(shù)后8周5-HT6RmRNA表達(dá)開始升高(P<0.05)。
　　3.2、BCCAo術(shù)后即給予選擇性5-HT6R拮抗劑SB-399885干預(yù)4周,VaD-SB399885

18、組大鼠腦5-HT6RmRNA較VaD-Placebo組表達(dá)升高(P<0.01)。
　　4、海馬CA1區(qū)、皮層5-HT6受體免疫組化檢測(cè)結(jié)果
　　4.1、免疫組化顯示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元5-HT6受體在BCCAo術(shù)后1周表達(dá)開始減少(P<0.01),術(shù)后4～8周表達(dá)明顯減少(P<0.01);皮層神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)在BCCAo術(shù)后2天、1周、4周持續(xù)下降(P<0.01),術(shù)后8周皮層神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)增多。
　　

19、4.2、BCCAo術(shù)后給予選擇性5-HT6R拮抗劑干預(yù)4周,VaD-SB399885組大鼠海馬、皮層神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)與VaD-Placebo組比較無明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后4周和8周,血管性癡呆大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯空間學(xué)習(xí)和記憶缺損,學(xué)習(xí)、記憶障礙和海馬、皮層缺血性神經(jīng)損傷均隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)加重。
　　2、雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后腦5-HT6RmRNA

20、明顯下降,以術(shù)后4周的表達(dá)水平最低,術(shù)后8周5-HT6RmRNA表達(dá)輕度回升,仍較假手術(shù)組表達(dá)水平低;海馬CA1區(qū)和皮層5-HT6受體隨腦缺血持續(xù)而表達(dá)下降,術(shù)后8周皮層5-HT6受體表達(dá)升高,鑒于5-HT6受體表達(dá)下調(diào)或其拮抗效應(yīng)具有促進(jìn)記憶、改善認(rèn)知的作用,推測(cè)腦缺血后神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)下調(diào)可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗缺血性腦損傷所產(chǎn)生的功能代償。
　　3、雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后給予選擇性5-HT6R拮抗劑SB-399885可減