Celecoxib阻斷肺癌血管擬態(tài)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是其最主要的病理類型。超過40％的NSCLC患者初診即為進(jìn)展期，不適于手術(shù)治療。盡管放化療、靶向治療和免疫治療等治療手段已取得重要進(jìn)展，但是肺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移仍然是治療的瓶頸，尋找新療法阻斷肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移已成為當(dāng)前的迫切需求。
　　腫瘤血管形成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，血管擬態(tài)是肺癌血管形成的重要形式。血管擬態(tài)是由高侵襲性腫瘤細(xì)胞模擬內(nèi)皮細(xì)胞形

2、成功能性血管樣結(jié)構(gòu)的形式，近年來，已被報(bào)道與肺癌抗血管藥物耐藥性、肺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，血管擬態(tài)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，針對血管擬態(tài)的特異性阻斷方法更是缺乏。因此，探索肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)的分子機(jī)制及拮抗手段，對于防治肺癌細(xì)胞生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移從而改善患者預(yù)后具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。
　　Celecoxib是一種環(huán)氧化酶2(COX-2)選擇性抑制劑，具有抗炎、抗腫瘤生長、抑制血管新生、以及增敏放化療的作用。我們嘗試使用Cel

3、ecoxib抑制肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)，發(fā)現(xiàn)Celecoxib能夠抑制肺癌血管擬態(tài)，并與COX-2表達(dá)無直接關(guān)系，可能存在其他的作用靶點(diǎn)。近年研究也顯示，Celecoxib的抗腫瘤作用可不依賴于COX-2，存在脫靶效應(yīng)（off-target effect）。我們推測，Celecoxib可能作用于COX-2以外的分子靶點(diǎn)，從而阻斷肺癌血管擬態(tài)。
　　方法:
　　1.Celecoxib對肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)的作用
　　選取3株肺癌細(xì)

4、胞株（A549、H1650和H460），在三維Matrigel基質(zhì)膠中觀察肺癌細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的情況，PAS染色驗(yàn)證其血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)特征;5Gy放射線作用于肺癌細(xì)胞株，觀察其在Matrigel基質(zhì)膠中的管狀結(jié)構(gòu)形成能力;在培養(yǎng)基中加入一定濃度的環(huán)氧合酶(COX-2)抑制劑Celecoxib，24小時(shí)后，重復(fù)Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)，探討Celecoxib對肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)的影響。

5、　　2.生物信息學(xué)方法預(yù)測Celecoxib的新靶點(diǎn)
　　選取Qiagen公司的血管新生基因芯片數(shù)據(jù)庫，包括84個(gè)參與血管新生的關(guān)鍵基因，將這些血管新生相關(guān)蛋白作為Celecoxib新靶點(diǎn)分析的分子庫。在UniProt和PDB數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選蛋白3D結(jié)構(gòu)，在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載Celecoxib結(jié)構(gòu)。用MGLTools1.5.6軟件處理受體蛋白與配體小分子結(jié)構(gòu)，保存為pdbqt文件。以蛋白中心某個(gè)原子為中心設(shè)置對接盒子，用

6、Autodock_ vina1.1.2作為分子對接工具，計(jì)算Celecoxib與每個(gè)蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)和親和力，搜索前20個(gè)最佳結(jié)合位點(diǎn)。用PLIP計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)與Celecoxib相互作用的殘基詳情。選取親和力高的蛋白比較其與已知抑制劑結(jié)合位點(diǎn)以及與Celecoxib的結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)配受體間是否有功能性結(jié)合。
　　3.Celecoxib新靶點(diǎn)的初步驗(yàn)證
　　將生物信息學(xué)方法預(yù)測出的與Celecoxib功能性結(jié)合的潛在新靶點(diǎn)，

7、包括APN、AKT1、ITAV（基因?yàn)镮TGAV）和NOS3，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由于未能購買到NOS3抗體，我們以APN、AKT1、ITAV為研究對象，并將COX-2作為對照分子。
　　(1)利用熒光光譜技術(shù)，將Celecoxib與4種蛋白(APN、AKT1、ITAV、COX-2)混合，用多功能酶標(biāo)儀測定混合物的同步熒光光譜及其在不同溫度(25℃、29℃、32℃)下的熒光猝滅光譜，通過熒光猝滅特征，推斷Celecoxib與蛋白的直接結(jié)

8、合能力。
　　(2)在3株肺癌細(xì)胞株(A549、H1650和H460)中，檢測APN、AKT1、ITAV、COX-2的表達(dá)差異;在5Gy放射線作用下，檢測三株肺癌細(xì)胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表達(dá)變化;在Celecoxib作用下，檢測三株肺癌細(xì)胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表達(dá)變化。
　　(3)選用5周齡雌性BALB/c裸小鼠，將肺癌細(xì)胞株經(jīng)皮下注射，建立肺癌移植瘤小鼠模型，隨機(jī)分為4組（親本細(xì)胞對

9、照組、Celecoxib組、放射治療組、放射治療+Celecoxib組）;放射線處理為腫瘤局部給予15Gy X線(320KV)照射，Celecoxib處理為灌胃給予Celecoxib。切除腫瘤組織，經(jīng)免疫熒光雙染（mCD31和hE-cad）和PAS染色觀察血管擬態(tài)形成情況。
　　結(jié)果:
　　1.Celecoxib抑制肺癌血管擬態(tài)
　　不同肺癌細(xì)胞株（A549、H1650和H460）在Matrigel基質(zhì)膠中均能形成管狀

10、結(jié)構(gòu)，PAS染色呈陽性，顯示其具有血管擬態(tài)特征;在5Gy劑量放射線作用下，肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)形成能力顯著增強(qiáng)(P＜0.01);在Celecoxib作用下，血管擬態(tài)完全消失。而該現(xiàn)象與COX-2的表達(dá)關(guān)系不密切。
　　2.Celecoxib與4種血管新生蛋白有功能性結(jié)合
　　84個(gè)血管新生蛋白數(shù)據(jù)庫中，54個(gè)蛋白具有明確的3D結(jié)構(gòu)。與Celecoxib進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示，14個(gè)蛋白與Celecoxib結(jié)合自由能低于-8.0

11、kcal/mol，具有較高親和力;6個(gè)蛋白結(jié)合自由能低于-9.0 kcal/mol，具有高親和力;1個(gè)蛋白結(jié)合自由能低于-10.0 kcal/mol，具有更高親和力。進(jìn)一步分析Celecoxib與潛在靶蛋白及其抑制劑的結(jié)合能，模擬比較結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示Celecoxib與4個(gè)蛋白(APN、AKT1、ITAV、NOS3)存在功能性結(jié)合，也包括COX-2。
　　3.Celecoxib作用于3個(gè)血管新生新靶點(diǎn)
　　熒光光譜分析顯示

12、，隨著Celecoxib濃度升高，其與3種蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)混合物的熒光強(qiáng)度逐漸減弱;隨著溫度升高，混合物熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明Celecoxib與3種蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)均有直接相互作用。
　　隨著培養(yǎng)基中Celecoxib濃度的增加，4種基因(APN、AKT1、IGTAV和COX-2)表達(dá)均受到Celecoxib的抑制;不同細(xì)胞株中，放射線誘導(dǎo)不同基因(APN、AKT1、IGTAV)的表達(dá)

13、上調(diào)，Celecoxib可顯著抑制APN、AKT1和IGTAV的表達(dá)。
　　動物實(shí)驗(yàn)顯示，移植瘤組織中血管結(jié)構(gòu)顯示為小鼠血管內(nèi)皮顯色（mCD31陽性）和人肺癌細(xì)胞顯色（hE-cad陽性），存在血管擬態(tài)（嵌合血管）;放射線可增強(qiáng)該效應(yīng)，而Celecoxib可阻斷該效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.肺癌細(xì)胞具有血管擬態(tài)特性，放射線可增強(qiáng)該效應(yīng)，而Celecoxib可阻斷該效應(yīng)，其阻斷作用與COX-2表達(dá)水平關(guān)系不密切。
　

14、　2.除COX-2之外，Celecoxib可不同程度地直接作用于3個(gè)血管新生蛋白(APN、AKT1、ITAV)，是一種非COX-2依賴的脫靶效應(yīng)。
　　3.不同肺癌細(xì)胞株中，放射線可不同程度誘導(dǎo)APN、AKT1、ITAV的表達(dá)，Celecoxib可阻斷肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)，增強(qiáng)肺癌放射線敏感性，是Celecoxib抗腫瘤效應(yīng)的新發(fā)現(xiàn)。
　　4.通過分子擬合方法，預(yù)測Celecoxib“脫靶效應(yīng)”的血管新生分子靶點(diǎn)，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)