血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調(diào)控的分子機制.pdf

1、目標(biāo)：探究血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調(diào)控的分子機制，為卟啉癥的診斷和治療提供分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論依據(jù)。同時進一步闡明血紅素作為信號分子發(fā)揮功能的具體信號通路。
　　 方法：本實驗分七個部分研究血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調(diào)控的分子機制。(1)通過實時熒光定量PCR確定血紅素能夠控制胰腺外分泌酶原基因(cpa5，ctr1l，ctrb1，ela2l，try，tryl)的表達(2)運用原位雜交實驗探究關(guān)鍵調(diào)控因子

2、bach1和nrf2在斑馬魚胚胎中的表達情況。(3)通過雙色原位雜交實驗證實關(guān)鍵調(diào)控因子bach1和nrf2同時在斑馬魚胰腺中表達。(4)通過5’-RACE和3’-RACE實驗獲得bach1基因的mRNA序列信息，并克隆bach1基因編碼區(qū)序列，構(gòu)建bach1基因表達載體。(5)通過顯微注射cappedmRNA進行bach1和nrf2基因的過表達實驗。(6)通過顯微注射嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(MO，Morpholinoantisens

3、eoligonucleotides)進行bach1和nrf2基因的敲降實驗。(7)電泳遷移率實驗(EMSA)證實了斑馬魚的MafK蛋白能夠結(jié)合到胰腺外分泌酶原基因上游的MARE(Mafrecognitionelement)元件上。
　　 結(jié)果：(1)血紅素合成缺陷的斑馬魚突變體中6個胰腺外分泌酶原基因的表達下調(diào)，同時氯高鐵血紅素(hemin)能夠使突變體中的這些下調(diào)的胰腺外分泌酶原基因的表達有所恢復(fù)。(2)bach1基因在斑馬魚

4、胚胎的頭部、軀干部、內(nèi)臟部位均有表達。nrf2基因在斑馬魚胚胎的內(nèi)臟部位、頭部、軀干部的神經(jīng)節(jié)點部位表達。(3)bach1和nrf2基因都在斑馬魚的胰腺中表達。(4)獲得了bach1基因的序列信息和表達載體。(5)bach1基因的過表達導(dǎo)致6個胰腺外分泌酶原基因下調(diào)，相反，nrf2基因的過表達導(dǎo)致6個胰腺外分泌酶原基因上調(diào)。(6)bach1基因的敲降導(dǎo)致6個胰腺外分泌酶原基因上調(diào)，相反，nrf2基因的敲降導(dǎo)致6個胰腺外分泌酶原基因下調(diào)。