APC-CCdc20對G2-M期Akt活性的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景及目的：
　　Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在介導(dǎo)生長因子信號中發(fā)揮重要作用。Akt調(diào)控細胞周期進程，在細胞存活、生長與增殖、糖代謝以及染色體穩(wěn)定性等生物過程中發(fā)揮重要功能。眾多研究已經(jīng)表明，Akt與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是介導(dǎo)腫瘤代謝Warburg效應(yīng)的重要分子，是一種重要的癌基因。因此，研究Akt蛋白激酶的分子調(diào)控機制具有重要的理論價值和潛在的臨床應(yīng)用價值。盡管已有大量文獻報道G1-S期Akt相關(guān)信號通路的調(diào)

2、控機制，但G2/M期Akt的分子調(diào)控機制尚不清楚。APC/C泛素E3連接酶作為G2/M期細胞周期演進的最主要調(diào)控分子復(fù)合體，通過 Cdc20和 Cdh1這兩個激活分子（Activator），分別識別底物分子的D-box、KEN-box序列，對底物分子進行泛素化修飾，致使蛋白酶體依賴性的底物分子降解，促成細胞周期演進。本研究旨在揭示G2/M期Akt活性變化，探討APC/C對Akt活性的調(diào)控作用及其分子機制。
　　研究方法：
　

3、?。?）用Nocodazole（諾考達唑）對細胞進行同步化處理，使細胞周期阻滯于G2/M期，采用流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）加以驗證。
　?。?）G2/M期同步化后的細胞繼續(xù)生長，使細胞進入不同的細胞周期時相，采用免疫印跡法（immunoblot）檢測細胞周期不同時相Akt的活性。
　?。?）采用immunoblot檢測Cdh1和Cdc20在細胞周期不同時相中的表達水平。
　?。?）RNA干擾C

4、dh1和Cdc20表達水平后，采用immunoblot檢測干擾Cdh1和Cdc20的G2/M期Akt磷酸化水平的變化。
　?。?）為探索 Cdh1和 Cdc20調(diào)控 G2/M期 Akt活性的具體機制，采用immunoblot檢測Akt上游調(diào)控分子，包括PI3K各亞基以及mTORC2復(fù)合體各組成成分在 G2/M期的表達水平，并采用免疫共沉淀方法（Co-immunoprecipitiation, Co－IP）檢測mTORC2復(fù)合體形成

5、在G2/M期的變化。
　?。?）用 Etoposide（依托泊苷）處理同步化或未同步化的細胞，采用immunoblot和FCM方法比較細胞周期不同時相對細胞凋亡敏感性的影響。
　　研究結(jié)果：
　　（1）Akt在細胞周期的G2/M期位于S473和T308位點的磷酸化水平明顯降低，同時Cdh1和Cdc20在G2/M期表達高水平，提示APC/C可能參與G2/M期Akt活性的調(diào)控。
　?。?）G2/M期 mTORC2復(fù)合

6、體的形成減弱，為G2/M期Akt活性減低提供了機制解釋。
　?。?）干擾Cdc20后，G2/M期細胞Akt的磷酸化水平顯著增高。
　　（4）Akt的上游含有D-box或KEN-box序列的調(diào)控分子例如PI3K亞基以及mTORC2復(fù)合體各組分在G2/M期的表達水平與其它細胞周期時相相比無顯著區(qū)別，提示APC/C不是通過這些已知分子在G2/M期調(diào)控Akt的活性的，APC/C調(diào)控G2/M期Akt活性的具體機制還有待進一步探討。

7、r>　?。?）G2/M期Akt活性降低的細胞更容易發(fā)生Etoposide誘導(dǎo)的細胞凋亡。
　　研究結(jié)論：
　　G2/M期的Akt活性調(diào)控機制仍不甚明了。本研究發(fā)現(xiàn)G2/M期Akt S473和T308這兩個位點的磷酸化水平顯著下降，提示Akt活性在G2/M期的顯著下調(diào)。Akt在G2/M期活性的下降伴隨著mTORC2復(fù)合體形成減弱以及APC/C激活分子Cdc20和Cdh1表達增加，RNA干擾降低Cdc20的表達顯著增強G2/M期