大黃素對(duì)胃癌PRL-3表達(dá)與下游AKT、Bcl-2家族調(diào)控作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的和意義:
　　 胃癌是占世界高發(fā)腫瘤的第二位，占我國(guó)高發(fā)性消化道腫瘤的第一位，且發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的主要?dú)⑹?。單一的治療方法往往難以取得好的療效。如何針對(duì)患病個(gè)體實(shí)施綜合性的治療策略，一直為廣大腫瘤研究學(xué)者所關(guān)注。
　　 中藥治療腫瘤，具有療效確切、副作用少，有著其它治療方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)特別是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的進(jìn)展，抑癌中藥抗腫瘤的分子機(jī)制逐漸被一一揭示，這使中藥的現(xiàn)代化及世界化

2、成為可能。我國(guó)的藥用植物資源豐富，中藥的抗腫瘤活性已得到國(guó)際所公認(rèn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)當(dāng)前已對(duì)藥用植物中28個(gè)科（屬），3000多種以上中草藥進(jìn)行了抗癌篩選，其中含有抗癌活性成分的中草藥約有200種左右。
　　 常見抑癌中藥種類有清熱解毒類中藥、活血化瘀類中藥、軟堅(jiān)散結(jié)類中藥、化濕利水類、扶正類中藥等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)常見抑癌機(jī)制有:(1)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;(2)抑制腫瘤血管的生成;(3)調(diào)控癌基因的表達(dá);(4)提高機(jī)體免疫功能，下調(diào)免疫

3、抑制分子并影響其免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮;(5)逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性等。依據(jù)抑癌中藥的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)，有的放夭的去治療腫瘤，也為腫瘤的治療開拓了新的思路。
　　 大黃素（1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌），是蓼科植物虎杖的干燥根莖和根。其除了具有抗菌、止咳、降血壓作用外，還有著抗腫瘤作用。但其抗腫瘤機(jī)制研究不夠深入。我們研究了大黃素對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株細(xì)胞抑制及凋亡、PRL-3癌基因表達(dá)調(diào)控的影響;WangH等人通過研

4、究發(fā)現(xiàn)，PRL-3可以作為PI3K/AKT通路的上游調(diào)節(jié)分子，并在腫瘤轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的作用。我們繼續(xù)探討了大黃素對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，分析了其發(fā)揮抑癌作用的可能分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以5×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后，更換含大黃素培養(yǎng)基，使得實(shí)驗(yàn)組含不同濃度大黃素，對(duì)照組加等量培養(yǎng)基，內(nèi)含

5、與最高濃度組等量的DMSO;每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。置5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入20μl濃度為5mg/ml的MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄全部上清夜，每孔加DMSO200μl，37℃震蕩孵育10min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)A570nm的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率及大黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 2、將不同濃度的大黃素作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞24小時(shí)后，胰蛋白酶消化，PBS離心洗滌收集，稀釋至1

6、06/ml，以PBS重懸細(xì)胞，與適當(dāng)比例的吖啶橙/溴化乙啶熒光染液混合，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并分別計(jì)數(shù)早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、非凋亡的壞死細(xì)胞、活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率。
　　 3、將不同濃度的大黃素作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞24小時(shí)后，胰蛋白酶消化，調(diào)整待側(cè)細(xì)胞的密度為5×105-1×106個(gè)/ml，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液，加入適當(dāng)比例的Annexin-V-FITC和PI，混勻

7、室溫反應(yīng)15min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞率。
　　 4、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，分析52例胃癌患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本中的PRL-3mRNA表達(dá)情況，了解PRL-3mRNA在胃癌腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)差異。
　　 5、利用免疫印跡技術(shù)，分析52例胃癌患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本中的PRL-3蛋白表達(dá)情況，了解PRL-3蛋白在胃癌腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)差異是否與mRNA一致。
　　 6、通過

8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析及免疫組化方法，從轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測(cè)PRL-3、Bmi-1在胃癌中的表達(dá)，了解其表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，分析其臨床意義;
　　 7、大黃素作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，分別提取RNA及細(xì)胞內(nèi)總蛋白，檢測(cè)大黃素作用前后PRL-3mRNA及蛋白水平的變化，分析大黃素對(duì)PRL-3表達(dá)調(diào)控的影響;
　　 8、分析大黃素作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，PI3K/AKT通路

9、相關(guān)蛋白及其下游分子表達(dá)的變化，探討大黃素的可能抗腫瘤機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT法檢測(cè)大黃素抑制SGC-7901增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:大黃素抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖呈時(shí)間、濃度依賴性。不同濃度大黃素作用于胃癌細(xì)胞24、48、72小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生存率顯著降低（P＜0.01）;除30μM濃度組與45μM濃度組在24小時(shí)段相比P＜0.05外，其余組間差異明顯(P＜0.01)。各濃度大黃素組隨著作

10、用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生存率也顯著性下降，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、通過AO-EB染色法在熒光顯微鏡下觀察大黃素作用于SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明:作用24小時(shí)后對(duì)照組及15μM、30μM、45μM、60μM大黃素組的細(xì)胞凋亡率(％)分別為4.05±1.06、14.79±1.23、27.84±3.30、35.15±2.59、43.63±2.33;與對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性（P＜0.01）。
　　

11、 3、流式細(xì)胞儀Annexin-V-FITC法檢測(cè)不同濃度的大黃素作用于SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明:作用24小時(shí)后對(duì)照組及15μM、30μM、45μM、60μM大黃素組的早期凋亡細(xì)胞率(％)分別為3.52±1.05、11.63±1.54、23.58±3.14、30.45±2.96、37.25±2.06;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 4、52例胃癌及配對(duì)癌旁組織均可檢出PRL-3mRNA的表

12、達(dá)，胃癌腫瘤組織中PRL-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.57％±2.31％，癌旁組織中PRL-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.53％±0.42％，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5、胃癌腫瘤組織中PRL-3蛋白表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參照的比值為0.79±0.12，癌旁組織中PRL-3蛋白表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參照的比值為0.28±0.05，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 6、PRL-3及Bmi-1mRNA相對(duì)表

13、達(dá)水平在腫瘤≥5cm的胃癌組織中均高于＜5cm的胃癌組織;在Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中均高于Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織;在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織;在浸潤(rùn)至胃壁漿膜層或漿膜層以外的腫瘤組織中均高于漿膜層以下浸潤(rùn)的胃癌組織;但與患者的性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。另外PRL-3mRNA相對(duì)表達(dá)水平在低分化胃癌組織中高于中、高分化胃癌組織(P＜0.01)，而Bmi-1mRNA沒有表達(dá)差異(P＞0.05)。腫瘤組織中PRL-3

14、mRNA與Bmi-1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.653，P＜0.05)。
　　 7.胃癌組織的PRL-3及Bmi-1表達(dá)陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜/漿，呈棕色或棕褐色沉淀，點(diǎn)片狀分布，細(xì)胞核無染色。PRL-3蛋白在胃癌的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小和分化程度均無相關(guān)性(P＞0.05），與胃癌的TNM分期有相關(guān)性(P＜0.05），與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.01）。Bmi-1蛋白在胃癌的表達(dá)與性別、年齡和分化程度均無相關(guān)

15、性(P＞0.05)，與胃癌的TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P＜0.05），與腫瘤大小有顯著相關(guān)性（P＜0.01）。
　　 8、大黃素作用組可以下調(diào)PRL-3mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比，15μM大黃素組下調(diào)率為32.47％，60μM大黃素組下調(diào)率為87.72％，在15-60μM范圍內(nèi)呈濃度相關(guān)性，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 9、PRL-3在人胃癌細(xì)胞系有表達(dá)，且不同濃度的大黃素作用細(xì)胞后，

16、隨著藥物濃度的增加，PRL-3蛋白表達(dá)不同水平的下調(diào)，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 10、大黃素可以下調(diào)pAKT(Thr308)及pAKT(Ser473)蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而總AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化。
　　 11、與對(duì)照組比較，不同濃度的大黃素作用于細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，與對(duì)照組比較Bax蛋白表達(dá)均有不同水平的上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)均有不同水平的下

17、調(diào)，Bax/Bcl-2比率逐漸增高，其中30μM、45μM、60μM大黃素組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論:
　　 1、大黃素對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外增殖有抑制作用，并呈時(shí)間、濃度依賴性;大黃素體外可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的凋亡，提示大黃素抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能是通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的;
　　 2、PRL-3mRNA及其蛋白在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)均高于配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)，提示PRL-3

18、與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系;PRL-3的高表達(dá)與胃癌的侵襲和發(fā)展相關(guān);
　　 3、PRL-3在胃癌中表達(dá)水平的分析及其與Bmi-1聯(lián)合檢測(cè)可作為早期診斷胃癌、評(píng)估胃癌發(fā)展、了解胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子水平參考指標(biāo);
　　 4、大黃素在抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖、促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡過程中，PRL-3mRNA及蛋白水平表達(dá)下降，提示該基因的表達(dá)調(diào)控可能為大黃素抗腫瘤的作用靶點(diǎn)之一。
　　 5、大黃素調(diào)控PI3K/AKT信