果蠅Mre11精氨酸突變動物模型的建立及G2-M檢驗點檢測.pdf

1、在生物體中，DNA不斷受到內(nèi)源和外源損傷因子的威脅。為了保護遺傳信息的完整，細胞在生物進化過程中形成了一整套復雜的監(jiān)控網(wǎng)絡，用以監(jiān)測基因組的完整性，稱為DNA損傷應答。該網(wǎng)絡監(jiān)測DNA損傷的存在，傳遞損傷信號，實現(xiàn)多步的生物學反應，包括細胞周期阻滯、DNA損傷修復、端粒維持和細胞凋亡等。MRN復合物（酵母中MRX）由Mre11、Rad50和Nbs1（Xrs2）組成，是DNA損傷應答的一個關鍵組成部分，參與細胞周期檢驗點和損傷修復的各個方

2、面。MRN復合物可以結(jié)合在染色體DNA上，識別雙鏈斷裂，發(fā)出損傷信號，并在DNA修復起著重要的作用。研究表明，MRN復合物突變會導致腫瘤或衰老相關疾病的發(fā)生。Mre11是MRN復合物極其重要的成員之一。到目前為止，關于Mre11的結(jié)構和功能已經(jīng)進行了大量的研究。Mre11是一種高度保守的70 kDa大小的蛋白，它的N端具有Mn2+/Mg2+依賴性磷酸酯酶結(jié)構域，中部具有一個DNA結(jié)合結(jié)構域，C端含有一個甘氨酸-精氨酸富集區(qū)（Glycin

3、e and Arginine-Rich，GAR）。Mre11的主要功能包括單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)核酸內(nèi)切酶活性、3'–5'雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）核酸外切酶活性、較弱的DNA解旋酶活性及雙鏈斷裂修復和激活細胞周期檢驗點的功能。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠mre11引起小鼠胚胎致死。人的mre11基因突變導致共濟失調(diào)毛細血管擴張樣疾?。ˋtaxia Telangiec

4、tasia Like Disorder，ATLD），患者典型表現(xiàn)為共濟失調(diào)、神經(jīng)退行性病變、免疫缺陷及癌癥易發(fā)等。研究Mre11的功能將有助于人們了解相關疾病的發(fā)生發(fā)展。Mre11 GAR區(qū)域富含精氨酸，可以被蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1甲基化，調(diào)節(jié)Mre11的功能。研究發(fā)現(xiàn)，盡管Mre11 GAR區(qū)精氨酸的甲基化不影響ATM信號通路的激活和MRN復合物的形成及定位，但是對于Mre11核酸外切酶活性的維持、細胞周期檢驗點的激活及雙鏈斷

5、裂損傷的修復至關重要。
　　我們實驗室以果蠅為動物模型，長期致力于DNA損傷應答的研究。前期工作中成功建立了mre11缺失的果蠅株，發(fā)現(xiàn)mre11缺失的果蠅死于成蛹晚期，為研究Mre11的體內(nèi)生物學功能提供了較為理想的動物模型。前期研究將Mre11蛋白序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)Mre11的GAR區(qū)域較為保守；體外甲基化實驗發(fā)現(xiàn)果蠅Mre11蛋白可以被果蠅精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（Drosophila Arginine Methyltrans

6、ferase1，DART1）甲基化；Mre11與DART1之間存在蛋白質(zhì)間的相互作用，且這種相互作用不依賴GAR區(qū)域；為了進一步確定GAR區(qū)域精氨酸甲基化情況，針對GAR區(qū)域六個精氨酸位點分別制備了相應的位點特異性甲基化抗體，發(fā)現(xiàn)R559、R563、R565、R569四個位點可被甲基化。
　　為了進一步研究果蠅Mre11精氨酸甲基化在DNA損傷應答中的功能，本研究采用經(jīng)典的果蠅Ends-In方法，建立了mre114個甲基化位點的點